巢脾多糖脱蛋白工艺优化及其对油脂抗氧化活性的研究

殷 玲,吉 挺,张焕新,李冠华,战旭梅

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;2.扬州大学 动物科学与技术学院,江苏扬州225009)



巢脾多糖脱蛋白工艺优化及其对油脂抗氧化活性的研究

殷 玲1,吉 挺2,张焕新1,李冠华1,战旭梅1

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州 225300;2.扬州大学 动物科学与技术学院,江苏扬州225009)

本实验旨在对蜜蜂巢脾多糖(HCP)脱蛋白工艺进行优化,并分析其对食用油脂抗氧化作用,为HCP的开发利用提供理论依据。以蛋白脱除率和多糖损失率为指标,比较Sevage法、酶法和酶法-Sevage法对蜜蜂巢脾粗多糖中的蛋白脱除效果,并通过正交实验优化工艺。结果表明酶-Sevage法脱蛋白效果优于其它脱除方法,最优工艺参数为:木瓜蛋白酶添加量为2%,酶解温度为60 ℃,酶解时间为3 h,联用Sevage法脱蛋白2次,蛋白脱除率可达90.60%,多糖损失率20.36%。以过氧化值为指标,采用Schaal烘箱法分析HCP在菜籽油、大豆油、猪油体系中的抗氧化活性,研究结果表明:HCP在菜籽油及大豆油中抗氧化效果不明显,而在猪油中表现出较好的抗氧化效果,HCP添加量达到0.08% 时,POV值比空白对照组降低了17.14 meg/g。

巢脾,多糖,脱蛋白,食用油脂,抗氧化活性

巢脾是蜜蜂生活和繁衍的场所,因此留有大量幼虫的茧衣,花粉,蜂蜜,蜂王浆,蜂胶及其分泌物,分析发现蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分如多糖、生物碱、鞣质、有机酸、昆虫激素以及苷类等[1-3]。作为动物中药,蜜蜂巢脾具有抗癌抑菌杀菌,杀虫攻毒,祛风镇痛,降血压,降血脂,抗氧化(清除自由基)等多种生物学及药理学价值[4]。近年来,随着人们对天然多糖研究的深入,天然多糖所具有的调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、降低固醇等各种生理功能逐渐为人们所重视,多糖已经开始在食品、药物、功能性保健品以及化妆品等领域进行开发应用[5-6]。蜜蜂巢脾多糖(HCP)是蜜蜂巢脾中的主要功效成分,有着重要的开发价值和广阔的应用空间,而目前对于巢脾多糖的提取纯化及开发应用仍处于空白。本实验对木瓜蛋白酶除蛋白工艺进行优化,确定蜜蜂巢脾多糖脱蛋白的最佳条件,同时使用烘箱自氧化法研究蜜蜂巢脾多糖对食用油脂抗氧化性能,为提高巢脾多糖纯度,进一步研究蜜蜂巢脾多糖的生物活性及开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

意大利蜜蜂老巢脾 购自扬州大学实验蜂场;食品级木瓜蛋白酶(120 万U/g);牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝、葡萄糖、正丁醇、氯仿、无水乙醇、硫酸、苯酚、硫代硫酸钠、抗坏血酸、叔丁基对苯二酚,以上试剂均为分析纯;菜籽油、大豆油、猪油(新鲜猪板油熬制而成)。

台式低速大容量离心机-TD5A-WS 金坛市津南仪器制造有限公司;旋转蒸发器RE-52D 上海青浦沪西仪器厂;手提式高速中药粉碎机DFF-100 上海新诺仪器设备有限公司;紫外可见分光光度计-754 上海菁华科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 巢脾多糖的提取 选用3年以上意大利蜜蜂老巢脾,粉碎过筛后加水加热30 min后用纱布挤干,残渣重复提取2次,合并滤液,旋转蒸发浓缩。冷却后加入无水乙醇静置沉淀离心,弃上清后烘干即可获得巢脾粗多糖。

1.2.2 多糖含量的测定方法 采用硫酸苯酚法[7],以葡萄糖做标准曲线。多糖损失率的计算按以下公式计算:

多糖损失率(%)=(C1-C2)/C1×100

式(1)

式中:C1为脱蛋白前多糖溶液浓度,C2为脱蛋白后多糖溶液浓度。

1.2.3 蛋白质含量的测定 以牛血清白蛋白为对照品,采用考马斯亮蓝 G-250法[8]测定蛋白质含量。蛋白质脱除率按以下公式进行计算:

蛋白质脱除率(%)=(A1-A2)/A1×100

式(2)

式中:A1为脱蛋白前溶液蛋白浓度,A2为脱蛋白后溶液蛋白浓度。

1.2.4 巢脾多糖蛋白去除综合评分 综合评分按以下公式计算:

式(3)

式中:C1为脱蛋白前多糖溶液浓度,C2为脱蛋白后多糖溶液浓度。

1.2.5 Sevage法 取1 g/100 mL粗多糖溶液50 mL,加入其体积1/4的Sevage试剂(V正丁醇∶V氯仿=1∶4),剧烈振摇20 min,4000 r/min离心,取上清液,得1 次脱蛋白多糖溶液,按上述步骤分别处理2～6次,测定不同处理次数蛋白去除率和多糖损失率[8]。

1.2.6 木瓜蛋白酶法单因素及正交实验 木瓜蛋白酶酶法的单因素条件为:固定酶解温度为50 ℃,酶解时间为3 h,木瓜蛋白酶的添加量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%;固定木瓜蛋白酶的添加量为2%,酶解时间为3 h,当解温度分别为30、40、50、60、70 ℃;固定木瓜蛋白酶的添加量为2%,酶解温度为50 ℃,酶解时间分别为1、2、3、4、5 h。

在单因素实验的基础上,以A蛋白酶用量、B酶解时间、C酶解温度为主要因素,以蛋白质脱除率和多糖损失率为指标,采用L9(34)表进行正交实验,对联合脱蛋白法的条件进行优化,具体因素及水平见表1。

表1 酶法脱蛋白的正交设计Table 1 Orthogonal design for enzyme method deproteinization

1.2.7 酶法-Sevage法 按照酶法脱蛋白质的最佳条件,对巢脾粗多糖进行除蛋白,将多糖溶液90 ℃水浴4 min,灭酶后按“1.2.5”进行Sevage法处理。

1.2.8 HCP对食用油脂抗氧化作用的测定 油脂氧化实验采用Schaal烘箱法[9],按照食用油脂质量的0.02%、0.04%、0.08%分别加入HCP到50 g油脂中,0.02%的茶多酚(PG)及0.02%叔丁基对苯二酚(TBHQ)做阳性对照,纯油样作为空白对照,置于65 ℃烘箱中,定时(0、4、8、12、16 d)检测每份油样中的过氧化值(POV)。油脂POV测定具体方法参照GB/T 5009.37-2003[10]。

2 结果与分析

2.1 Sevage法脱蛋白次数对巢脾多糖脱蛋白效果的影响

由图1可知,随着操作次数的增加,蛋白质脱除率也逐渐上升,4次后,蛋白质脱除率即可达到70%以上,但操作次数的增加也会导致多糖的损失,在4次脱蛋白后蛋白质的去除呈上升趋缓,但多糖损失率逐渐上升,综合考虑,Sevage处理4次脱蛋白时效果最佳,此时蛋白脱除率为70.84%,多糖损失率为33.52%。

图1 Sevage法脱蛋白次数对巢脾多糖脱蛋白的影响Fig.1 Effect of Sevage deproteinization times on protein removal and polysaccharide loss

表2 酶法脱蛋白正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test for enzyme method deproteinization

2.2 酶解法脱蛋白的单因素实验结果

2.2.1 酶解温度对巢脾多糖中脱蛋白效果的影响 由图2可知,酶解温度范围在 50～60 ℃时蛋白质脱除率比较高;温度高于50 ℃时,蛋白去除率下降,当温度为50 ℃时对巢脾多糖中脱蛋白去除率最佳。此时蛋白脱除率为76.96%,多糖损失率为24.96%。

图2 酶解温度对巢脾多糖蛋白脱除的影响Fig.2 Effect of different enzymolysis temperature on protein removal and polysaccharide loss

2.2.2 酶解时间对巢脾多糖中脱蛋白的影响 由图3可知,酶解3 h后蛋白去除率出现下降趋势,多糖损失率也同时趋缓。可能源于底物浓度的降低导致了酶解效率的降低。综合去除率和多糖损失率考虑,酶解时间在3 h去蛋白效果最好,此时蛋白去除率为77.39%,多糖损失率为24.31%。

图3 酶解时间对巢脾多糖蛋白脱除的影响Fig.3 Effect of different enzymolysis time on protein removal and polysaccharide loss

2.2.3 木瓜蛋白酶添加量对巢脾多糖中脱蛋白的影响 由图4可知,蛋白质脱除率随酶添加量的增加而不断增大,多糖损失率也随木瓜蛋白酶添加量增加略微上升,酶的添加量在2%时蛋白去除效果最好,此时蛋白去除率为79.11%,多糖损失率为19.13%。

图4 酶添加量对巢脾多糖蛋白脱除的影响Fig.4 Effect of different enzymolysis addition on protein removal and polysaccharide loss

2.3 正交设计实验结果与分析

根据单因素实验确定的实验因素及水平,以蛋白去除率及多糖损失率平均值作为评分标准,以蛋白酶的用量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)为3个因素,选取3个适宜的水平,选L9(34)表进行正交实验,实验结果如表2所示。

由表2可知,3个因素对蜜蜂巢脾多糖木瓜蛋白酶脱蛋白效果影响程度大小为A>B>C,即木瓜蛋白酶的添加量对脱蛋白效果影响最大,其次是酶解温度然后是酶解时间。最佳除蛋白工艺为:A2B3C3,即木瓜蛋白酶添加量为2%,酶解温度为60 ℃,酶解时间为3 h,经验证,此条件下的蛋白去除率和多糖损失率分别为85.10%和28.16%。

2.4 酶法-Sevage法脱蛋白

由图5可知,使用上述酶法最优条件处理粗多糖溶液后,接着Sevage法脱蛋白 2 次,蛋白脱除率达到最高,但再增加处理次数脱蛋白率没有明显的增加,多糖损失率却明显增高。故确定酶-Sevage联合法的最佳工艺为酶用量2%,时间3 h,温度60 ℃,联用Sevage法处理2次,蛋白脱除率可达到90.60%,多糖损失率20.36%。与Sevage的蛋白去除率和多糖损失率70.84%和33.52%、酶法的蛋白去除率和多糖损失率85.10%和28.16%对比,木瓜蛋白酶-Sevage法脱除巢脾多糖蛋白效果明显优于单一的脱蛋白方法。

图5 Sevage脱蛋白次数对酶-Sevage法脱蛋白的效果的影响Fig.5 Effect of Sevage deproteinization times on protein removal and polysaccharide loss by enzyme-Sevage method

2.5 HCP对食用油脂的抗氧化作用

2.5.1 HCP对菜籽油过氧化值(POV)的影响 HCP对菜籽油过氧化值(POV)影响的测定结果如图6所示。总体而言,HCP对于菜籽油的POV影响较小,在第16 d时,HCP组的菜籽油PVO略低于空白组,而远高于PG及TBHQ组。说明HCP对于菜籽油的抗氧化作用较小。

图6 HCP对菜籽油过氧化值(POV)的影响Fig.6 Effect of different doses of HCP on POV value of rapeseed oil

2.5.2 HCP对大豆油过氧化值(POV)的影响 HCP对大豆油过氧化值(POV)影响的测定结果如图7所示。HCP对于大豆油的POV影响呈现出一定的量效关系,随着添加量的增加,其POV越小,但总体而言,影响较小,在第16 d时,HCP组的大豆油PVO显著低于空白组,但同样远高于PG组及TBHQ组。说明HCP对于大豆油的抗氧化效果不明显。

图7 HCP对大豆油过氧化值(POV)的影响Fig.7 Effect of different doses of HCP on POV value of soybean oil

2.5.3 HCP对猪油过氧化值(POV)的影响 HCP对猪油过氧化值(POV)影响的测定结果如图8所示。第8 d时,各组猪油POV基本接近,8 d后空白组POV随时间增加明显且高于其它各组的试样,对于HCP组,随着HCP添加量的增加,对猪油的氧化抑制效果越显著,添加量达到0.08%时,其抗氧化效果与PG接近,POV比空白对照组降低了17.14 meg/g,但弱于TBHQ,说明HCP对动物油脂具有良好的抗氧化效果。

图8 HCP对猪油过氧化值(POV)的影响Fig.8 Effect of different doses of HCP on POV value of lard oil

3 结论

在我国传统医学中,蜜蜂巢脾常被用来作为治疗鼻炎、乙型肝炎、痛疽肿毒等许多种疾病的配伍之用[2]。我国是养蜂大国,蜂群饲养量已超过750万群,每年淘汰的蜂巢数量十分可观,但从目前来看,巢脾单一作为药制品、生物制品、食品等的开发不多。蜂巢基本仅限于临床配伍和提取蜂蜡之用,大多用于蜂蜡提取,大量的其它有效成分如生物碱、酶类、多糖、甙类等被丢弃。究其原因,蜂巢脾化学组成复杂、主要功效成分不明晰是限制蜜蜂巢脾开发利用的主要原因之一。本实验对蜂巢有效成份之一巢脾多糖的纯化及其对食用油脂的抗氧化活性进行了研究,为蜂巢的开发利用提供数据基础。通过单因素和正交实验确定了HCP除蛋白的木瓜蛋白酶-Sevage法最优工艺条件:酶用量2%,时间3 h,温度60 ℃,联用Sevage法处理2次,蛋白脱除率可达到90.60%,多糖损失率20.36%。此法既充分发挥酶法可保持多糖活性的优点,又可减少Sevage法的使用次数,从而规避了传统Sevage法多糖损失率高、化学试剂残留高的缺点[9],同时大大提高了除蛋白的效率,对于蜜蜂巢脾多糖的纯化较为适用。对食用油脂的抗氧化活性检测结果显示HCP对大豆油和菜籽油的抗氧化活性较低,而对猪油有较好的抗氧化活性,高剂量下抗氧化效果接近于茶多酚,而蜂巢原料成本远低于茶多酚,提示HCP可作为一种新型天然食品抗氧化剂,在肉品保鲜应用上具有较好的开发前景。

[1]匡邦玉,匡海鸥. 蜜蜂生物学[M]. 昆明:云南科学技术出版社,2003:140-141.

[2]褚亚芳. 蜜蜂巢脾抗氧化、抑菌和抗炎活性以及抗生素残留研究[D]. 杭州:浙江大学,2010.

[3]赵红霞,黄文忠,陈华生,等. 蜜蜂巢脾提取物对小鼠免疫调节作用的影响[J]. 天然产物研究与开发,2016,28(1):125-130.

[4]国家药典委员会,中国药典[M]. 北京:化学工业出版社,2005.

[5]Fang J,Wang Y,LV X,et al. Structure ofβ-glucan from Grifola frondosa and its antitumor effect by activating Dectin-1/Syk/NF-KB signaling[J]. Glycoconiugatce J,2012,29(5-6):365-377.

[6]张淑杰,康玉凡. 近5年天然活性多糖国内外研究进展[J/OL]. 食品工业科技,http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20160926.0910.036.htm

[7]中华人民共和国农业部. NY/T1676-2008食用菌中粗多糖的测定[S]. 北京:中国标准出版社,2008.

[8]伍善广,赖泰君,孙建华,等. 蚕蛹多糖脱蛋白方法研究[J].食品科学,2011,32(14):21-24.

[9]American Oil Chemists’ Society. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society[M].4th ed. Chicago:AOCS,1989:8-53.

[10]中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会. GB/T 5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法[S]. 北京:中国标准出版社,2003.

Optimization of deproteinized technology and anti-lipidperoxidation activity of polysaccharide from honeybee comb

YIN Ling1,JI Ting2,ZHANG Huan-xin1,LI Guan-hua1,ZHAN Xu-mei1

(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China;2 College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In order to provide theory base for further development of honeybee comb polysaccharide(HCP),the process of deproteinization from HCP was optimized,and the antioxidant activity on edible fats was investigated. The efficiency of deproteinization with different methods such as Sevage,enzyme,and enzyme-Sevage method was evaluated in terms of the ratio of protein removal from HCP and polysaccharide loss,and the optimal conditions were determined by single factor experiment and orthogonal analysis. The result showed that enzyme-Sevage method with higher efficiency of deproteinization was better than others. The optimal conditions of deproteinization were:enzyme usage of 2%,temperature of 60 ℃,time of 3 h,after 2 times of Sevage deproteinization,the ratio of deproteinization and polysaccharide loss were 90.60% and 20.36%,respectively. Using peroxide value(POV)as evaluation index,the antioxidant effects of HCP on edible oils and fats were evaluated by Schaal oven method.The results showed that the antioxidant effect of HCP on rapeseed oil and soybean oil was not obvious,but showed better effect on lard oil. As the addition of HCP reached to 0.08%,the POV value decreased by 17.14 meg/g compared with the blank group.

honeybee comb;polysaccharides;deproteinization;edible oil;antioxidant activity

2016-12-23

殷玲(1983-), 女, 博士, 讲师, 研究方向：蜂产品开发及深加工研究,E-mail:lingyin_txx@163.com。

江苏农牧科技职业技术学院重点科研课题(NSFRC1401);江苏农牧科技职业技术学院科研课题(NSFPT201521);校企合作课题(00010115004)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)13-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.038