响应曲面法对产蓝色素链霉菌YLA0的高产色素条件优化

朱素英,王宜磊

(菏泽学院生命科学系,山东菏泽 274015)



响应曲面法对产蓝色素链霉菌YLA0的高产色素条件优化

朱素英,王宜磊*

(菏泽学院生命科学系,山东菏泽 274015)

以链霉菌YLA0作为出发菌株来优化其高产蓝色素的培养条件,单因素实验的基础上,筛选出C/N比、pH、培养时间三个单因素,利用Box-Behnken的响应曲面设计进一步优化。结果表明,链霉素YLA0高产蓝色素的最佳培养条件为:C/N比为14∶1、pH7.63、培养时间169.69 h,得率11.67 mg/100 mL。该条件下的实际值为优化值的97.04%,说明该模型可靠,可用于链霉菌YLA0高产蓝色素培养条件的优化。

链霉菌YLA0,响应曲面法,蓝色素,优化

天然色素因其无毒、非致癌性以及在环境中可降解,在食品、纺织、化妆品等行业逐渐受到人们的重视[1-2]。利用微生物生产色素,具有易于培养,繁殖快,不受季节、空间和环境的影响等优于动物色素与植物色素的多种特点[3-5]。同时发现微生物产蓝色素除了可以用作染料外,有些微生物蓝色素还具有一定的药用和营养价值。南海海洋细菌Pseudomonassp.产生的蓝色素,以及灵菌红素具有抗肿瘤活性[7-9]等,蓝色素作为三大基本色素之一,可以和红、黄色素调成各种颜色。另外国内外从微生物中提取蓝色素研究相对其它色素较少[5],目前研究产生蓝色素微生物主要集中在链霉菌[7-8],其它的还有节杆菌属[10]、假单胞菌属[11]、紫色杆菌属[12]、杜擀氏菌属[8]等少数种类,因此利用微生物生产蓝色素研究尤为重要。

本研究以首次从菏泽牡丹根际分离诱变得到的链霉菌YLA0作为实验材料,通过发酵培养,研究多种单因素对链霉菌YLA0产蓝色素的影响,以及在单因素的基础上首次利用响应曲面法对链霉菌YLA0高产蓝色素的培养条件优化,为链霉菌YLA0产蓝色素进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

链霉菌(Streptomycessp.)YLA0 从菏泽牡丹根际分离出的产蓝色素链霉菌(Streptomycessp.)YLA11菌株,经诱变、筛选而获得。蓝色素的链霉菌(Streptomycessp.)YLA0菌株已被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC No:11335。固体斜面培养基 高氏一号琼脂培养基;种子培养基 参考文献[13];发酵培养基 高氏一号培养基:可溶性淀粉20.0 g,干酪素0.5 g,硝酸钾(KNO3)1.0 g,氯化钠(NaCl)0.5 g,磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5 g,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g,硫酸锌(ZnSO4)0.01 g,硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01 g,蒸馏水1000 mL,pH7.4。试剂和药品均为国产分析纯。

高速冷冻离心机 湖南赫西离心机仪器有限公司;HZQ-F160振荡培养箱 哈尔滨东联电子有限公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海博讯实业公司;TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 链霉菌YLA0的培养 将低温保存的链霉菌YLA0菌种活化后接种在斜面培养基上进行产孢,长出孢子后,挑2环孢子接种到种子培养液中,种子培养液为于250 mL锥形瓶装30 mL的无菌培养液,于30 ℃,200 r/min摇床培养24 h后,再转接入摇瓶发酵培养液中,30 ℃摇床培养200 r/min培养7 d。

1.2.2 色素的提取方法 发酵液于5000 r/min离心10 min,得上清液再次12000 r/min离心15 min,将第二次离心所获得的上清液经截流分子量10 kDa滤膜超滤,超滤浓缩液中加浓H2SO4进行酸沉,后再次5000 r/min离心15 min,弃上清液,得沉淀一,在沉淀一中加入40%的氢氧化钠水溶液调节pH至7.5,沉淀一溶解,得清液A,向清液A加入无水乙醇,进行醇沉处理,醇沉处理完毕离心分离得沉淀二,将沉淀二烘干至恒重,得纯化固体蓝色色素。

1.2.3 蓝色素含量测定方法 蓝色素含量测定参考文献[14],将得到的蓝色素溶解定容于100 mL乙醇溶液,用分光光度计进行全波长扫描,在波长596 nm处有最大吸收峰,最大吸收波长596 nm下测色素溶液的光密度(OD)。

蓝色素得率的计算方法:Y(%)=W/L×100

式(1)

式(1)中:Y为蓝色素得率,W为得到纯化固体蓝色色素质量,L为发酵液的体积。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 无机离子对蓝色素产量的影响 在高氏一号培养基的基础上,固定其它物质的量不变,按照0.05 g/100 mL培养基加入不同的无机盐,代替培养基中的NaCl。115 ℃,高压灭菌15 min,接种后30 ℃培养。

1.2.4.2 碳源、氮源对蓝色素产量的影响 在高氏一号培养基的基础上,分别用2 g/100 mL的葡萄糖、甘露糖等取代淀粉作为碳源,分别用0.1 g/100 mL等量的硝酸铵、氯化铵等物质取代硝酸钾进行氮源利用情况实验,分别研究不同碳源和氮源对蓝色素产量的影响。115 ℃,高压灭菌15 min,接种后30 ℃培养。

1.2.4.3 C/N(碳/氮)比对蓝色素产量的影响 以高氏一号培养基为基础,固定氮源的量不变(KNO3为1 g/L),分别称量100 mL培养基中不同量的淀粉(3.2,2.88,2.56,2.24,1.92,1.6,1.28,0.96,0.64,2.0 g使C/N为12.5)使C/N比符合表5要求。115 ℃,高压灭菌15 min,接种后30 ℃培养。

1.2.4.4 初始pH对色素产量的影响 在高氏一号培养基的基础上,分别用10%的HCl和NaOH溶液调节培养基的初始pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11常规灭菌冷却后以10%的接种量接种,观察初始pH对色素产生的影响。

1.2.4.5 发酵时间对色素产生的影响 从发酵培养的第24 h开始,每隔24 h发酵瓶中取10 mL菌液。再经12000 r/min离心10 min,弃沉淀后,测量在596 nm处的OD值。依据色素图谱观察色素产生量的变化,直到色素浓度不再变化。

1.2.5 响应曲面实验设计 以无机离子浓度、碳源、氮源、不同C/N、初始pH、培养时间作为单因素来探明对色素产生的影响,数据结果运用excel2007处理。

在以上单因素的基础上,选择C/N、初始pH和培养时间三个因素,Design Expert进行Box-Behnken三因素三水平实验设计。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.3 数据统计分析

Design Expert软件进行响应曲面数据分析和绘图。其它数据利用excel 2007进行分析和绘图,方差分析利用spss 22.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对蓝色素产生的影响

表2 无机离子对色素产生的影响Table 2 Effect of inorganic ions on pigment production

2.1.2 碳源、氮源对产蓝色色素的影响 由表3可以看出,链霉菌YLA0能够较好利用的碳源为:木质素、淀粉、半纤维素、木聚糖、麦芽糖,只有木质素可以产生极深蓝色的蓝色素,且菌丝生物量可达5.828 g/100 mL,半纤维素可以产生深蓝色的蓝色素,但菌丝生物量产生较少,其它三种只能产生颜色较浅的蓝色素。不能作为蓝色色素分泌的碳源物质有:木糖、蔗糖和羧甲基纤维素钠、果胶;能分泌少量色素的碳源物质为:葡萄糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇。

表3 碳源对蓝色素产生的影响Table 3 Effects of carbon source on the blue pigment production

注:较好利用:+++,利用:++,利用较差:+,不利用:-,表4同。

表4 氮源对蓝色素产生的影响Table 4 Effects of nitrogen sources on the production of blue pigment

表5 不同C/N对色素产生的影响Table 5 Effects of C/N ratio on the pigment production

图1 培养时间对色素产量的影响Fig.1 Effects of culture time on the yield of blue pigment production

由表4看出,该菌不能利用磷酸铵、磷酸二氢铵、牛肉膏、酵母提取物、干酪素做氮源产生色素,但除氯化铵和磷酸二氢铵利用较弱外,其它的基本上都能利用其生长;产生色素较少的氮源物质有硫酸铵、氯化铵、草酸铵,因此铵盐不利于色素的产生。牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母提取物做氮源均不能产生蓝色素;产生蓝色素较好的氮源是玉米粉，硝酸钾次之、尿素再次之;就生物量来说,干酪素明显高于其它氮源,在进行种子培养时可考虑加入。

2.1.3 不同C/N对色素产生的影响 由表5可知,C/N为14∶1时,产生色素的量最大,生物量也较大。

2.1.4 初始pH对色素产生的影响 由表6可以看出,初始pH为7左右时最适于色素的分泌和菌丝体的生长。

表6 pH对蓝色素产生的影响Table 6 Effects of pH on the pigment production

表8 响应曲面二次回归模型的方差分析Table 8 Results of the analysis of variance to the response surface quadratic model

注:**表示在p<0.01时极显著;*p<0.05时显著。2.1.5 培养时间对色素分泌的影响 对图1色素OD值折线图的分析,发现链霉菌YLA0在培养过程中,在48 h开始产生色素,但产量较小,144 h开始大量产生,从168 h开始增速变缓,甚至216 h时，OD值开始稍有下降。根据成本节约原则,选取168 h为提取时间的终点。

2.2 响应曲面优化培养条件

利用design-expert软件,培养条件的Box-Behnken设计实验结果如表7。

表7 蓝色素产量的响应曲面设计及结果Table 7 Response surface design and results of the blue pigment production

利用表7实验结果,design-expert软件二次多项式回归拟合,蓝色素OD值对自变量的方程为:Y=-20.60975+2.56559A-1.15605B+0.2515C+0.11662AB-0.00067708AC+0.00286458BC-0.29035A2-0.003525B2-0.000861285C2

根据表7结果,利用design-expert软件进行绘图分析,从图2可以看出三者的交互效应,等高线越扁,交互效应越明显,等高线越圆,交互效应影响越小,从图可以看出,AB、BC等高线较扁,说明PH与C/N、C/N与培养时间之间的交互响应对蓝色素的产量影响最显著。

图2 交互作用对链霉菌YLA0蓝色素产量影响的响应面图Fig.2 Response surface plots showing the effects of interactions on the production of blue pigmengt from Streptomyces sp. YLA0

利用Design-expert软件进一步分析,根据表7数据,获得蓝色素产量最高的链霉菌YLA0的最佳培养条件为:C/N比为14∶1、pH7.63、培养时间169.69 h,其吸光度(OD值)为1.69,最佳条件下理论得率12.03 mg/100 mL,即每100 mL发酵液,含有12.03 mg的蓝色素。

2.3 实验验证

为验证优化条件的可行性,在实验室条件下以C/N比为14∶1、pH7.63、培养时间169.69 h(约为169 h 41 min),高氏一号培养基为基础进行培养链霉菌YLA0,三个重复,提取获得蓝色素的OD值平均值为1.64,得率为 11.67 mg/100 mL。可知实际值为优化值的97.04%。说明优化条件是可行有效的。

3 结论

利用响应曲面法研究链霉菌YLAO培养条件对其蓝色素产生的影响,首先确定了无机离子、碳源、氮源等被利用的情况,选取不同C/N、初始pH、培养

时间三个影响显著单因素梯度(其它单因素梯度实验因篇幅限制省略),结果显示添加适量Mn2+,木质素,玉米粉有利于蓝色素的产生,14∶1的碳氮比,pH7,培养时间162 h为最佳单因素培养条件;在单因素基础上,利用Design-expert软件的Box-Behnken设计,对链霉素YLAO产蓝色素产量与碳氮比、pH、培养时间建立二次多元回归方程,获得高产色素的最佳条件为C/N比为14∶1、pH7.63、培养时间169.69 h,其吸光度为1.69,最佳条件下理论得率12.03 mg/100 mL。且经实验室验证，OD值为1.64，得率为11.67 mg/100 mL,说明模型是合理可行的,可很好的预测链霉素YLAO的蓝色素产量。

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Optimization of fermentative conditions for high yield blue pigmentfromStreptomycessp.YLA0 using response surface methodology

ZHU Su-ying,WANG Yi-lei*

(Department of Life Science,Heze University,Heze 274015,China)

Streptomycessp. YLA0 was used as the experimental material to optimize the culture condition of high yield blue pigment. Based on the single factor experiment,C/N ratio,pH and culture time as three single factors were selected and optimized by Box-Behnken response surface design. The results showed that the optimal culture conditions ofStreptomycinsp. YLA0 were as follows:C/N ratio was 14∶1,pH7.63,culture time was 169.69 h,and the yield was 11.67 mg/100 mL. Under this condition,the actual value was 97.04% of the optimized value,and the results showed that the model was reliable and could be used to optimize the culture condition ofStreptomycessp. YLA0.

Streptomycessp. YLA0;response surface methodology;blue pigment;optimization

2016-12-08

朱素英(1980-)，女，硕士，讲师，研究方向：生物有效成分的提取与利用，E-mail:zhu-suying@126.com。

*通讯作者:王宜磊(1964-)，男，本科，教授，研究方向：微生物生理学及发酵工程，E-mail:279095893@qq.com。

微生物与发酵重点实验室项目；菏泽学院校级项目(XYKJ16)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)13-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.031