热加工对豆乳蛋白质溶解性和脲素酶活性的影响

陈 昊,李婷婷,王嘉熙,郝建敏,于冬蕾,房媛媛,朱秀清,,*

(1.东北农业大学国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150028;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;3.中国矿业大学信电学院,江苏徐州 221116)



热加工对豆乳蛋白质溶解性和脲素酶活性的影响

陈 昊1,李婷婷2,王嘉熙3,郝建敏2,于冬蕾2,房媛媛1,朱秀清1,2,*

(1.东北农业大学国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150028;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;3.中国矿业大学信电学院,江苏徐州 221116)

本文研究不同热加工处理对豆乳蛋白质的影响,采用传统热煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆对豆乳蛋白质氮溶解指数(nitrogen soluble index,NSI)和脲素酶活性的影响,同时对不同热加工处理的豆乳蛋白进行表面疏水性、自由巯基和透射电镜分析。结果表明:在90 ℃煮浆15 min的传统热煮浆条件下,蛋白质的NSI值为81.62%±1.07%;在650 W微波煮浆40 s条件下,NSI值为75.35%±0.65%;在100 ℃加压高温煮浆3 min,NSI值为91.31%±1.50%,均显著高于生豆乳的NSI值(69.03%±0.82%)。传统热煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆三种热处理方式均可以降低脲素酶活性。通过对蛋白质自由巯基、表面疏水性和透射电镜观察分析，传统热煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆与生豆乳相比,三种热处理方式均使蛋白质自由巯基含量显著降低(p<0.05);表面疏水性显著升高(p<0.05);豆乳体系油滴与蛋白共溶、分散性更好。由此可见,不同热加工处理的豆乳蛋白质的溶解性提高是通过深层改变蛋白的结构来实现的。

传统热煮浆,微波煮浆,加压高温煮浆,蛋白质溶解性,脲素酶活性

豆乳是一种安全、营养、健康的植物蛋白质饮料,含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、多种维生素以及矿物质等营养成分[1-2]。传统的豆乳生产工艺主要经过浸泡、磨浆、过滤、加热及杀菌等工序[3-4],其中加热是豆乳生产中的重要环节。生豆乳经过加热处理后,蛋白质发生热变性,脂肪氧化酶等酶类失活,植物凝集素等抗营养因子发生钝化,使豆乳的品质得到改善[5-7]。

近几年来,传统加热[8-9]、微波加热[10]、加压高温加热[11]是豆乳生产主要的热处理方式。俞小良等[12]研究发现豆乳经 5～10 min(90 ℃)煮浆后豆乳中大颗粒物质增加,但15～20 min 煮浆后豆乳粒径减小,并且豆乳稳定性增加。黄敏璋[13]研究发现,在560 W、22 s的微波煮浆条件下,豆浆内部温度达到75 ℃时,能达到较好的杀菌效果,且延长保质期。赵忠良等[14]研究发现,微压煮浆提高了豆乳中蛋白粒子的含量,豆乳平均粒径更小,提高了豆乳在长期储藏中的稳定性。虽然豆乳的热处理研究在不断进行,但有关豆乳热处理方式系统性的探讨却鲜有报道。

脲素酶为一种抗营养因子,其呈阳性时,会影响人体对豆乳中营养物质的吸收和利用。豆乳中蛋白质溶解性对豆乳加工用途和商品价值具有很重要的意义。豆乳蛋白变性后,蛋白结构展开并发生热聚集,可能会使豆乳的蛋白溶解度下降,影响到豆乳的感官性质、营养价值和商品价值,但适当热处理,即使完全变性,蛋白也有很高的溶解度[15]。表面疏水性、自由巯基维持蛋白质的空间结构,对蛋白质结构的稳定性、构象和功能性质具有重要的作用[16-18]。本文在借鉴前人研究的基础上,采用不同热处理方式:传统热煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆对豆乳中蛋白质进行适当的变性处理,通过蛋白质的NSI值和脲素酶活性进行表征,并通过表面疏水性、自由巯基和透射电镜等指标对豆乳蛋白质结构特性进行分析,明确加热方式对豆乳中蛋白质特性的影响,期望发现“加工方法-结构变化-功能特性”之间的关系,旨在通过选择适当的工艺,开发出高蛋白质、高稳定性的豆乳产品,为豆乳的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆 北大荒股份有限公司(含蛋白质37.6%,脂肪18.55%,水分10.98%);十二烷基磺酸钠(SDS)、尿素、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、Tris Sigma公司;甘氨酸(Gly)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) Amresco公司;硫酸、盐酸、硼酸 北京市化工厂;硫酸铜 天津市津东天正精细化工有限公司;碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 天津市光复精细化工研究所。

微波炉 美的集团股份有限公司;低温高速离心机 美国Beckman公司;722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;F-4500荧光分光光度计 日本HITACHI公司;JEM-2010透射电子显微镜 日本电子株式会社;HYP-2型消化炉 上海纤检仪器有限公司;LNK-871型凯氏定氮快速自动蒸馏器 江苏省宜兴市科教仪器研究所;AD-506型豆浆机 佛山市顺德区爱德实业有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;4614针式过滤器(0.45 μm) 美国PALL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生豆乳的制备 大豆→清洗、除杂→浸泡(豆水比1∶10 m/v、10～12 h再置于3‰ w/v NaHCO3溶液中5 min)→清洗→豆浆机磨浆(豆水比1∶7 m/v)→冷却→过滤(用四层纱布过滤)→生豆乳。

1.2.2 生豆乳热加工处理 传统煮浆:将200 mL生豆乳置于500 mL烧杯中,在70、80、90 ℃水浴中分别煮浆5、10、15、20 min,取出冷却至室温,密封,置于4 ℃冰箱内保存待测。

微波煮浆:将200 mL生豆乳置于500 mL烧杯中,在650 W微波煮浆10、20、30、40、50 s,取出冷却至室温,密封,置于4 ℃冰箱内保存待测。

加压高温煮浆:将200 mL生豆乳置于500 mL密封瓶中,在0.10(温度为100 ℃)、0.12(温度为105.03 ℃)、0.14(温度为109.43 ℃)、0.16(温度为113.35 ℃)、0.18(温度为116.89 ℃)、0.20 MPa(温度为121 ℃)条件下,灭菌锅中分别煮浆1、3、5 min,取出冷却至室温,置于4 ℃冰箱内保存待测。

1.2.3 豆乳中蛋白质NSI值的测定 参照Guo[19]等人的方法,取豆乳于离心管中,在4 ℃ 4000 r/min离心15 min。用凯氏定氮法测定上清液中蛋白质含量,每个样品测定3次,按式(1)计算蛋白质NSI值。

式(1)

1.2.4 脲素酶活性的测定 采用GB/T 5009.183-2003[20]的方法测量脲素酶活性,取样量为2 mL。

1.2.5 巯基含量的测定 参考Boatright[21]等人的方法。取1 mL稀释液与5 mL Tris-Gly缓冲溶液(0.086 mol/L Tris-0.09 mol/L Glycine-4 mmol/L Na2EDTA,pH8.0)混合,经混匀器混匀,加入50 μL 4 mg/mL DTNB溶液,25 ℃保温1 h。样品进行离心处理(3000×g,10 min),上清液过0.45 μm过滤器,在412 nm处测定吸光度值。巯基含量计算公式如下:

SH(μmol/g)=73.53×A412×D×C

式(2)

式(2)中:A412-样品吸光度值;D-稀释倍数;C-豆乳蛋白质浓度(mg/mL)。

1.2.6 疏水性的测定 参考Wagner[22]等人的方法测定样品的表面疏水性。用蒸馏水稀释成不同浓度的样品溶液,使溶液中蛋白浓度控制在0.005～0.1 mgPro/mL,利用1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalene-sulfonate,ANS)作为荧光探针。取20 μL ANS(8.0 mmol/L)溶液加到7.0 mL样品溶液中振荡均匀,并于室温下避光10 min,在激发波长390 nm、发射波长470 nm以及狭缝5 nm的条件下于荧光分光光度计下比色。以荧光强度值对蛋白溶液浓度作图,记斜率为蛋白质的表面疏水性指数,以表示表面疏水性。

1.2.7 透射电镜 采用改进后的Cruz[11]方法进行透射电镜(TEM)观察,将碳膜包被的铜网放置在干净的蜡盘上,用吸管将制备好的300倍稀释后的样品滴加在铜网上,盖上盘,静置20 min;用滤纸吸掉铜网上的样品,透射电镜在25 kV观察样品。

1.3 实验数据分析

采用Origin 8.5设计软件、SPSS Statistics 17.5软件对数据进行处理与分析,实验3次平行取平均值。

2 结果与讨论

2.1 不同热加工方式对豆乳中蛋白质NSI值和脲素酶活性的影响

表1 传统热煮浆对脲素酶活性的影响Table 1 Effect of traditional heating process on the urease activity

注:+为阳性,表示脲素酶有活性,-为阴性,表示脲素酶失活;表2、表3同。2.1.1 传统热煮浆对豆乳中蛋白质NSI值和脲素酶活性的影响 如图1所示,NSI值随着煮浆温度升高而增加,豆乳在70 ℃和80 ℃条件下,随着煮浆时间的延长NSI值增加,煮浆温度为70 ℃时NSI值最大为75.09%±0.39%,煮浆温度为80 ℃时NSI值最大为76.01%±0.11%,但煮浆温度在90 ℃条件下NSI值增加最显著(p<0.05),豆乳在90 ℃、15 min煮浆后,NSI值达到了最大值为81.62%±1.07%,显著高于生豆浆的NSI值69.03%±0.82%(p<0.05)。传统煮浆加热使豆乳中蛋白质发生变性,分子由球状变为伸张状态,引起蛋白质亚基发生解离反应生成可溶性物质,从而使蛋白质溶解性得到提高[23]。然而,进一步加热,更多非极性基团分子暴露于分子表面,亚基间聚合为不溶性蛋白质聚合物,蛋白质水化作用减弱,NSI值降低[19]。因此,适当地提高煮浆温度、延长煮浆时间有利于改善蛋白质溶解性[24]。

图1 传统热煮浆对豆乳中蛋白质NSI值的影响Fig.1 Effects of traditional heating process on the NSI value of proteins in soymilk注:柱子上方的小写字母不同表示差异显著, p<0.05。图2、图3同。

如表1所示,加热处理可以有效地灭活脲素酶活性,灭活效果受到热处理温度及时间的影响。70 ℃煮浆脲素酶活性降低不显著(p>0.05),煮浆15 min后脲素酶仍呈现强阳性;90 ℃可以显著地降低豆乳中脲素酶活性(p<0.05),在90 ℃煮浆20 min后脲素酶已完全被钝化。脲素酶具有一定的热稳定性,是由于一些保护性蛋白质的存在,煮浆过程中温度升高,使保护蛋白质的空间结构遭到破坏,因此脲素酶活性加速失活[25]。

2.1.2 微波煮浆对豆乳中蛋白质NSI值和脲素酶活性的影响 如图2所示,随微波时间的延长,NSI值先增加后减小,经40 s微波煮浆后,蛋白质NSI值达到最高为75.35%±0.65%,显著高于生豆浆的NSI值69.03%±0.82%(p<0.05)。微波技术利用微波能引发极性分子发生高频振荡,使分子间发生摩擦、撞击等相互作用,进而实现微波能、动能与热能间的转化,达到加热的目的[22,26]。经过微波煮浆后,蛋白质化学键断裂,紧密排列的蛋白质空间结构变得伸展,使蛋白质与水结合能力增强,引起NSI值的升高。但过度微波煮浆导致蛋白质过度变性,蛋白质水合作用减弱,NSI值降低。

图2 微波煮浆对豆乳中蛋白质NSI值的影响Fig.2 Effect of microwave heating process on protein NSI value

如表2所示,在微波650 W时,脲素酶活性随微波煮浆时间延长而逐渐降低,微波煮浆40 s脲素酶活性呈弱阳性,继续增加煮浆时间,脲素酶活性变化不明显。当电磁波在介质内部起作用时,蛋白质受到交变电场的作用而剧烈振荡,摩擦而产生热,这种热效应使得蛋白质分子结构发生改变[22],从而破坏脲素酶活性。

表2 微波煮浆对脲素酶活性的影响Table 2 Effect of microwave heating process on the urease activity

2.1.3 加压高温煮浆对豆乳中蛋白质NSI值和脲素酶活性的影响 如图3所示,

表3 加压高温煮浆对脲素酶活性的影响Table 3 Effect of high temperature with pressure heating process on the urease activity

表4 不同热加工处理对豆乳中蛋白质自由巯基和表面疏水性的影响Table 4 Effects of different heating process on the free sulfhydryl and surface hydrophobicity of proteins in soymilk

注:同行不同小写字母表示差异显著,p<0.05。在压力0.10～0.20 MPa逐渐增强(即温度逐渐增加)的情况下,NSI值变小。100 ℃煮浆3 min豆乳中蛋白质NSI值最高为91.31%±1.5%,显著高于生豆浆的NSI 值69.03%±0.82%(p<0.05)。加压处理使豆乳颗粒分散性增强,高温短时处理使得蛋白质结构发生改变,结构伸展促使蛋白质水合作用增强,溶解度增加。然而随着处理时间的延长,蛋白质变性严重,溶解度下降。加压高温处理,热效率较高,处理时间短,有利于企业降低热损失,提高生产效率。

图3 加压高温煮浆对豆乳中蛋白质NSI值的影响Fig.3 Effect of high temperature with pressure heating process on protein NSI value

如表3所示,加压高温煮浆可以有效地降低脲素酶活性。0.10 MPa(100 ℃)时煮浆1 min后脲素酶活性呈强阳性,煮浆3 min后脲素酶活性呈弱阳性,而经煮浆5 min后脲素酶活性呈阴性。相比0.10 MPa加压高温煮浆,0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 MPa时煮浆1 min后脲素酶已完全失活,脲素酶活性呈阴性。在高温条件下,大豆中脲素酶不稳定,因此可以通过高温处理钝化脲素酶活性。

2.2 不同热加工处理对豆乳中蛋白质表观特性的影响

2.2.1 不同热加工处理对豆乳蛋白质自由巯基和表面疏水性的影响 热加工处理之后,豆乳的蛋白质表观特性也会发生变化。采用豆乳NSI值最高和脲酶活性最低时的热处理方式即:传统煮浆(90 ℃煮浆15 min)、微波煮浆(650 W微波煮浆40 s)、加压高温煮浆(100 ℃加压高温煮浆3 min)处理豆乳,蛋白质自由巯基和表面疏水性变化如表4所示。传统煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理的豆乳中蛋白质的自由巯基含量分别为(1.52±0.057)、(1.74±0.042)、(1.24±0.076) μmol/g,均显著低于生豆乳的自由巯基含量(2.07±0.09) μmol/g(p<0.05)。对豆乳进行加热处理过程中,蛋白质吸收热量后,蛋白质分子发生解离形成亚基,而亚基间通过二硫键发生聚合或是形成不溶性聚集体,使蛋白质自由巯基含量降低[27]。郭凤仙等[28]报道大豆分离蛋白(SPI)在90～100 ℃加热15 min后,其自由巯基含量降低;Shimoyamada M[17]的研究结果也与本研究一致。

微波煮浆产生高频电磁波,使微波电场中的极性分子处于高速摇摆状态,分子剧烈运动的结果造成了分子间的碰撞和摩擦加剧,从而产生大量的热量,使蛋白质受热变性[29],空间结构伸展,内部巯基暴露于分子表面,因此微波煮浆自由巯基含量显著高于传统煮浆,但吸收热量的同时,也会促使自由巯基向-S-S-间转化,自由巯基含量下降,微波煮浆自由巯基含量显著低于生豆乳。在加压高温煮浆条件下,蛋白质会在疏水性作用力的驱动下发生聚合反应,蛋白质发生聚合后,自由巯基转移到分子内部,降低了被巯基氧化的机率[30],因此加压高温煮浆自由巯基含量最低。

蛋白质表面疏水性同样是蛋白质分子重要的表观特征[31]。传统煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理的豆乳中蛋白质的表面疏水性为214.18±7.21、294.92±6.03、316.24±6.04,显著高于生豆乳的112.32±14.19(p<0.05),经传统热煮浆处理后,豆乳中蛋白质进一步变性,蛋白空间结构展开,但加热会使蛋白分子分解、聚集,并不是所有疏水基全部暴露出来[32],微波煮浆、加压高温煮浆处理后蛋白质变性更严重,分子展开的程度更大,使埋藏在内部的非极性基团暴露于表面,增加蛋白质表面疏水性[33]。

2.2.2 不同热加工处理对豆乳中蛋白质粒子结构影响 利用透射电镜高分辨率和高放大倍数的特点,对不同热加工处理的豆乳进行透射电镜观察,结果如图4所示,生豆乳含有粒度较大的蛋白聚集体a,大小不一的球形油滴b,油滴附近发现脂肪蛋白聚集物c,并且蛋白与油滴分布不均匀。传统煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理的豆乳体系发生相似的变化,豆乳颗粒分散性增强,油滴b圆球形向不规则形状变化,油滴分散性较好,蛋白聚集体a减少,油滴b周围吸附脂肪蛋白聚集物c,增加了界面稳定性,也有利于豆乳蛋白的水合作用,提高其溶解度。

图4 不同热加工处理豆乳的透射电镜图(×25000倍)Fig.4 Transmission electron micrographs of soymilk by different heating process(×25000)

传统热煮浆后,蛋白质自由巯基含量降低,表面疏水性增强,NSI值升高,表明煮浆使蛋白质分子展开,亚基间发生解离、聚合,但以解离为主,此时蛋白质表面亲水性基团占据优势,宏观表现为分子形状不规则,蛋白聚集物减少;与传统热煮浆相比,微波煮浆蛋白质自由巯基含量降低幅度较小,表面疏水性升高幅度较大,微波煮浆过程中分子伸展程度大,更多分子发生解离,较少亚基聚合,因此宏观表现为微波煮浆的分子形状比传统煮浆细小。加压高温与传统煮浆相似,加压高温煮浆使蛋白质自由巯基含量降低幅度较大,表面疏水性升高幅度较高,因此蛋白聚集体更少。经过传统煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理后,蛋白质自由巯基含量降低,表面疏水性增强,使蛋白质分子空间结构展开,亚基间发生解离,亚基解离是二硫键、疏水键等次级键断裂的结果,此时蛋白质表面亲水性基团占主导,表现为豆乳颗粒分布均匀、分散性好,稳定性提高。

3 结论

不同热加工处理对豆乳中蛋白质NSI和脲素酶均有影响:在90 ℃煮浆15 min的传统热煮浆条件下,蛋白质的NSI值为81.62%±1.07%;在650 W微波煮浆40 s条件下,NSI值为75.35%±0.65%;在100 ℃加压高温煮浆3 min,NSI值为91.31%±1.5%,均显著高于生豆浆的NSI 值69.03%±0.82%(p<0.05)。传统热煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆三种煮浆工艺均可以抑制脲素酶活性。

传统热煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理对豆乳中蛋白质特性的影响趋于一致:传统煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理的豆乳中蛋白质的自由巯基含量分别为(1.52±0.057)、(1.74±0.042)、(1.24±0.076) μmol/g,均显著低于生豆乳的自由巯基含量(2.07±0.09) μmol/g(p<0.05)。传统煮浆、微波煮浆、加压高温煮浆处理的豆乳中蛋白质的表面疏水性分别为214.18±7.21、294.92±6.03、316.24±6.04,显著高于生豆乳的112.32±14.19(p<0.05)。三种热处理的豆乳体系发生相似的变化,油滴圆球形向不规则形状发展,蛋白聚集体减少,宏观表现为分子形状不规则,豆乳颗粒分散性增强的微观结构。

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Effect of different heating process on the protein solubilityand urease activity of proteins in soymilk

CHEN Hao1,LI Ting-ting2,WANG Jia-xi3,HAO Jian-min2,YU Dong-lei2,FANG Yuan-yuan2,ZHU Xiu-qing1,2,*

(1.National Soybean Engineering and Technique Research Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150028,China;2.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;3.School of Information and Electrical Engineering,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China)

In order to explore the effect on protein characteristics of soymilk by heating processes including traditional heating,microwave heating and high temperature with pressure heating,the protein NSI value,urease activity,surface hydrophobicity,free sulfhydryl and transmission electron microscope were studied. The results showed that,compared with the NSI value of protein of raw soymilk was 69.03%±0.82%,the NSI value of protein was 81.62%±1.07% by traditional heating at 90 ℃ for 15 min. After microwave heating,the NSI value of protein was 75.35%±0.65% at 650 W for 40 s. The NSI value of protein of high temperature with pressure heating was 91.31%±1.5% at 100 ℃for 3 min. Urease activity was inhibited by the processing of traditional heating,microwave heating,high temperature with pressure heating. Compared with raw soymilk,the free sulfhydryl content of protein was remarkably declined by traditional heating,microwave heating and high temperature with pressure heating(p<0.05),but the surface hydrophobicity of protein was remarkably higher(p<0.05),respectively. The microscopic structure analysis of the soymilk showed that soymilk protein and oil droplets cosolvent had uniform distribution and better dispersion. Thus,the improvement of protein solubility of soymilk after different heating processes was achieved by the deep change of protein structure.

traditional heating;microwave heating;high temperature with pressure heating;protein solubility;urease activity

2016-12-06

陈昊(1979-),男,硕士研究生,研究方向:大豆精深加工,E-mail:chh_301@163.com。

*通讯作者:朱秀清(1968-),女,硕士，研究员,研究方向:大豆精深加工,E-mail:xqzhuwang@163.com。

黑龙江省科研院所创新能力提升计划(YC2014D003);哈尔滨市创新人才项目(2014RFQYJ179)。

TS202.3

A

1002-0306(2017)13-0090-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.017