壳二糖、壳三糖单体制备及其结构分析

徐 庆,陈列欢,秦 臻,陈启明,邱勇隽,赵黎明,*

(1.华东理工大学生物反应器国家重点实验室,食品科学与工程系,上海 200237;2.惠州长龙生物技术有限公司,广东惠州 516000)



壳二糖、壳三糖单体制备及其结构分析

徐 庆1,陈列欢2,秦 臻1,陈启明1,邱勇隽1,赵黎明1,*

(1.华东理工大学生物反应器国家重点实验室,食品科学与工程系,上海 200237;2.惠州长龙生物技术有限公司,广东惠州 516000)

壳寡糖因自身结构特征而存在多种生物活性,目前对壳寡糖的活性研究大部分是不同聚合度的混合物。为获得单一聚合度壳二糖、壳三糖,采用了专一性壳聚糖酶对壳聚糖进行降解,运用薄层色谱法(TLC)判断酶解反应终点,并采用高效液相色谱法(HPLC)法进行定量分析。结果表明酶解组分主要为壳二糖、壳三糖,含量分别为65.63%,32.48%。将酶解后的混合组分采用实验室自制的阳离子交换树脂QY-H003对酶解产物进行分离,以盐酸浓度为C1=1.25 mol/L、C2=1.55 mol/L为洗脱剂进行梯度洗脱得到两个组分。采用TLC、HPLC、红外光谱(FT-IR)及核磁共振氢谱(1HNMR)检测手段对组分进行分析。分离纯化获得的壳二糖、壳三糖组分经HPLC法检测,纯度分别98.06%,96.00%。壳二糖回收率达92.46%、壳三糖回收率达95.53%。该制备工艺放大后可实现高纯度壳二糖、壳三糖单体规模化制备,为壳二糖、壳三糖的生理活性研究及应用提供物质基础。

壳聚糖,酶解,离子交换色谱法,壳二糖,壳三糖

壳寡糖(Chitooligosaccharide,COS),又称几丁寡糖,其分子结构是由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成,聚合度在2～10内的低分子壳聚糖[1]由壳聚糖经过酸或酶等方法降解而成。壳寡糖因分子量小、水溶性好、无毒、带正电、生物兼容性好[2]等优势而广泛应用于化工、医药、食品、农业等方面[3]。现大量研究表明壳寡糖具有降血糖[4]、降血脂[5]、降胆固醇[6]、抗癌[7]、抗肿瘤[8-9]、抗菌抑菌[10]及能提高机理免疫能力[11]等活性。

壳二糖、壳三糖具有良好的抗菌、抗氧化作用[12-14]。Frantz等[15]采用金属亲和色谱,可制备纯度高于95%以上的壳二糖、壳三糖,但上样量低。琚洋洋[16]采用凝胶色谱法制备出壳二糖、壳三糖单体纯度分别为95.7%,97.1%,但340 mL的分离填料,上样量仍处于毫克级。高丽霞等[17]采用Bio-Gel P6和Bio-Gel P6 Fine凝胶柱进行,纯化后可制备纯度高于95%的壳三糖,但这一过程中需要二次纯化,制备周期较长。与金属亲和色谱和凝胶色谱相比,离子交换色谱分离精度高、上样量大。Li等[18]以CM Sephadex C-25为填料分离全脱乙酰化的壳寡糖,得到的壳二糖、壳三糖纯度可达99.3%、98.9%,但产量每天分别只有75、60 mg,同时该法以NaCl溶液为洗脱剂,在制备过程中引入了盐,增大分离难度,且产率有限。Xiong等[19]采用离子交换色谱法,以Dowex50WX8-20为分离介质,可分离制备壳二糖、壳三糖,两者纯度均超过98%,但该填料价格昂贵,不适合大规模应用。

以上报道的壳二糖、壳三糖的制备规模大多停留在毫克级,且使用的填料不易获得,难以规模化制备,无法满足大量基础研究和应用开发需求。为了更大规模的制备壳二糖、壳三糖单体,本研究以壳聚糖为原料,采用专一性壳聚糖对其进行降解,筛选了一种吸附容量较高的介质,并建立了一种壳二糖、壳三糖单体的制备工艺,制备规模达克级,对制备的壳二糖、壳三糖结构进行了表征分析,可为壳二糖、壳三糖规模化制备及研究应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖 莱州海力生物制品有限公司,脱乙酰度>95%;专一性壳聚糖酶 实验室筛选,酶活440.2 U/mg;强酸性阳离子交换树脂QY-H003 实验室自制;高效硅胶板 1.05554.0001、乙腈(HPLC级) 德国Merck公司;壳寡糖DP 1～7混合标准品 惠州长龙生物技术有限公司,纯度>95%。

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱分析系统:配有ELSD安捷伦G246B检测器 美国安捷伦公司;色谱柱:Asahipak NH2P-504E柱(4.6 mm ID×250 mm L) 日本Shodex公司;中压冷水夹套层析柱(16 mm ID×50 cm H) 上海华美实验仪器厂;BT100定时恒流泵、90-1型恒温磁力搅拌器 上海沪西实验仪器厂;752N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣实验仪器厂;LGJ-18C型冷冻干燥机器 北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 壳寡糖制备 准确称取10.00 g的壳聚糖,加入200 mL水均匀搅拌,30 min后,加入4.8 mL浓盐酸。加速搅拌，配成5%(w/v)的壳聚糖溶液,用0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液调制溶液为酶的最适pH为5.6。向体系中加入10.0 mg壳聚糖酶,在酶最适温度37 ℃条件下,转速为120 r/min进行水解反应,每隔8 h取样,100 ℃,10 min灭酶,以8000 r/min离心10 min,采用TLC法分析酶解液组分并判断反应终点,达反应终点后将酶解液置于100 ℃加热10 min终止反应,以8000 r/min离心10 min,去除沉淀。将上清液进行浓缩、冷冻干燥制成壳寡糖固体。

1.2.1.1 酶解反应时间的确定 采用TLC法[20]分析取的样品离心后的上清液,具体方法如下:在高效硅胶板上进行点样,上样量1.5 μL,各点间距为5 mm,距离层析板底端10 mm,上行法展开。展距为80 mm,采用的展开体系为正丙醇∶氨水∶水=60∶4∶30,以大茴香醛为显色剂,采用浸渍法，电烤炉均匀火烤至显色。显色剂配法:移取25 mL大茴香醛溶于450 mL无水乙醇中,后向体系中缓慢加入25 mL浓硫酸,再向其加入5 mL乙酸,混匀。

1.2.1.2 酶解终产物的HPLC分析 采用安捷伦1260系列高效液相色谱分析仪对酶解产物进行分析。色谱条件:色谱柱Shodex NH2P-504E(4.6 mm ID×250 mm L)。柱温30 ℃;流速V=1.0 mL/min;进样浓度5.0 mg/mL;进样量10 μL。检测器:安捷伦G246B型蒸发光散射。以乙腈(B)和水(A)为流动相采用梯度洗脱,条件如表1:

表1 HPLC法分析壳寡糖洗脱条件Table 1 The elution conditions of HPLC method analysis chitooligosaccharide

1.2.1.3 含量的计算

式(1)

其中,Wi表示组分i的含量,%;Ai表示HPLC图谱中组分i的峰面积;A表示HPLC分析图谱中所有峰的峰面积总和。

1.2.2 壳寡糖单体的分离

1.2.2.1 树脂的筛选 量取预处理好的各种树脂5 mL置于250 mL锥形瓶中,向锥形瓶中加入50 mL浓度为10 g/L自制的壳寡糖溶液,以150 r/min的转速处理12 h,采用减重法测定溶液中壳寡糖含量,采用产量法如式2计算各树脂静态吸附量Q:

式(2)

式中,Q为树脂体积吸附量,g/mL;C0为初始壳寡糖溶液浓度,g/L;C为吸附后最终溶液中壳寡糖浓度,g/L;V为溶液体积,mL;V0为加入的树脂体积,mL。

1.2.2.2 壳二糖、壳三糖的分离过程 采用吸附容量最高的强酸性阳离子交换树脂QY-H003进行分离实验,取预处理好的QY-H003树脂70.4mL装入层析柱中,并用去离子水洗至澄清,平衡后上样,柱子温度T=25 ℃,按照上样量与树脂体积比为60.0mg/mL上样4.22g。上样后先用去离子水进行洗脱,待洗脱至中性后开始以浓度为C1=1.25mol/L,C2=1.55mol/L两种不同浓度的盐酸为洗脱剂进行梯度洗脱并同时进行收集,流速为2.0mL/min时开始收集,前期每9min40s收集一管,共20管。后期每19min20s收集一管,共10管。采用滴定法测定各管酸浓度,绘制酸浓度随时间变化曲线。利用减重法测定各管糖浓度,绘制糖浓度洗脱曲线。采用TLC法对收集管成分进行定性分析,合并相同组分,多次旋蒸脱酸后,冷冻干燥成粉末。

回收率的计算:将合并后制得的单体质量与该组分上样量之比即为回收率。计算如式(3)所示:

式(3)

式中,Yi表示成分i的回收率(%);mi表示成分i回收的质量(g);mc表示组分i的上样量(g)。

1.2.3 壳二糖、壳三糖单体的表征

1.2.3.1 TLC法分析 取壳二糖、壳三糖单体均配成1%浓度的水溶液采用TLC法分析,具体方法详见1.2.1.1。

1.2.3.2 HPLC法分析 将制备的壳二糖、壳三糖单体配成5.0 mg/mL浓度的水溶液用于HPLC分析,具体方法参考1.2.1.2。

1.2.3.3 FT-IR法分析 采用KBr压片法,使用Nicolet 6700型傅立叶变换红外波谱仪对酶解产物及制备的单体在红外波数为4000～400 cm-1范围内进行扫描,扫描32次,分辨率4 cm-1。

1.2.3.41HNMR法分析 壳寡糖单体的核磁氢谱采用瑞士BrukerAVANCEIII400 MHz超导核磁共振仪分析,氘代水溶解壳二糖、壳三糖。

2 结果与讨论

2.1 壳寡糖的制备

2.1.1 酶解反应时间的确定 该专一性壳聚糖酶是属于内切型酶,在特定条件下可将壳聚糖降解成壳二糖、壳三糖。反应时间会影响最终的酶解液的组分的组成,酶解过程中每8 h的酶解液组分分析结果如图1所示,TLC图谱结显示,前四次(32 h前)取样,酶解产物主要为壳二糖、壳三糖、壳四糖。反应32 h之后,壳四糖的占比逐渐减少,反应至120 h时酶解产物主要是壳二糖、壳三糖,其他含量极少。实验表明,酶解反应120 h,壳聚糖可被壳聚糖酶降解成主要含壳二糖、壳三糖混合组分,因此，酶解时间选择120 h。

图1 酶解过程中产物的TLC图谱Fig.1 Thin layer chromatography analysis of hydrolysis products注:S指壳寡糖1～7混合标准品,1～15分别指第1～15次取样。

2.1.2 酶解终产物HPLC分析 制备的酶解组分采用HPLC分析的结果图谱如图2A、图2B所示,其中图2A为聚合度1～7标准品HPLC图谱,1～7糖的出峰时间分别为7.30、9.35、12.71、17.74、22.75、25.78、27.87 min,图2B显示的是酶解产物壳寡糖的HPLC图谱,其两主峰出峰时间及峰面积具体数据如表2所示,可知出峰时间分别为9.43、12.73 min,与标准品对应的是壳二糖、壳三糖。采用峰面积归一法,结合式(1)可知酶解产物中壳二糖、壳三糖的含量各占比例分别65.63%,32.48%。

图2 壳寡糖的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectrum of chitooligosaccharides注:A:1～7糖混合标准品,B:壳聚糖酶解产物。 表2 两组分的HPLC数据Table 2 The HPLC data of two components

组分主峰保留时间(min)主峰峰面积(Ai)总面积(A)峰面积占比(%)DP294393067614180666563DP3127346058714180663248

2.2 壳寡糖单体的分离

2.2.1 树脂的筛选 测定离子交换树脂 D113、HD-8、D001、D315、D152、QY-H003,12 h后,结果如图3所示。6种树脂对应的吸附容量分别为19.9、2.8、83.3、0.9、25.3、91.7 mg/mL,其中型号为QY-H003树脂对壳寡糖的吸附容量最高,选取该型号树脂用于分离实验。

图3 6种树脂对壳寡糖的吸附容量Fig.3 Static adsorption quantity of six kinds of resin

图4 收集各管的酸浓度、糖浓度及TLC分析Fig.4 Each tube acid concentration and chitooligosaccharide concentration of collection注:S指壳寡糖1～7混合标准品,1、2、3…30指收集的管号。

2.2.2 壳二糖、壳三糖的分离过程 收集管组分的分析：采用滴定法测定各管中的酸浓度,其测定结果如图4A所示。前6管酸浓度急剧上升,其原因是由于层析柱开始是残留水,第7管～30管酸浓度平稳上升,可以体现梯度洗脱过程的稳定性。

采用减重法测定各管的糖含量并绘制洗脱曲线。其测定结果如图4B所示。可以看出有三个洗脱峰,出峰时间分别为48 min 20 s、87 min、183 min 40 s。表明有三种物质被洗脱下来。且中间物质的含量面积最大,对应含量最高。

对收集的各管采用TLC法分析结果如图4C,在6号管开始,壳二糖被解吸附,13号管结束。13号管开始,壳三糖开始被解吸附,至28号管结束。为得到更高纯度,合并7～12号收集管,14～28号收集管。并旋蒸脱酸、冷冻干燥获得两个组分,获得的壳二糖的质量为2.56 g,壳三糖的质量为1.31 g,根据回收率式(3)可知:

2.2.3 壳二糖、壳三糖单体的表征

2.2.3.1 TLC法分析 制备的壳二糖、壳三糖采用TLC法分析,结果如图5所示,制备的壳二糖比移值Rf1=0.424,与标准品中壳二糖的比移值Rfm=0.417一致,制备的壳三糖的比移值Rf2=0.320与标准对照品壳三糖的比移值Rfn=0.317一致。说明制备的壳二糖、壳三糖与标准品一致。

图5 单体TLC分析图谱Fig.5 Thin layer chromatography analysis of glucosamine oligomers注:S指标准品,2、3分别指制备的壳二糖、壳三糖。

2.2.3.2 HPLC法分析 采用HPLC法分析制备的壳二糖、壳三糖单体,结果分别如图6A、图6B所示,两单体的保留时间及峰面积如表3所示。壳二糖保留时间是9.17 min,壳三糖保留时间是12.27 min,与标准品图2A壳二糖、壳三糖出峰时间一致。两者的纯度计算方法与含量计算方法一致,根据式(1),可得壳二糖含量为98.06%、96.00%。

图6 单糖HPLC图谱分析Fig.6 HPLC spectrum of chitooligosaccharide monomers注:(A)壳二糖,(B)壳三糖,图8同。 表3 制备的壳二糖、壳三糖HPLC数据Table 3 The HPLC data of chitobiose and chitotriose

组分主峰保留时间(min)主峰峰面积(Ai)总面积(A)峰面积占比(%)壳二糖917195880219974639806壳三糖1227132840513836619600

2.2.3.3 FT-IR法分析 采用FT-IR法分析制备的壳二糖、壳三糖,在波长为4000～400 cm-1进行扫描。结果如图7显示,两者红外扫描图谱极为相似,有相同的特征峰。与Pan等[21]研究对比可知,3426.3 cm-1左右是糖环中O-H及N-H的伸缩振动吸收峰,在2937.7 cm-1左右是糖环中C-H的伸缩振动吸收峰。1627.1 cm-1左右是酰胺I谱带。1523.1 cm-1左右是酰胺II谱带,1400.5 cm-1左右环羟基C-H变形振动,1090.9 cm-1左右的峰是C-O伸缩振动峰。892.9 cm-1左右是β-构型糖苷键,630.4 cm-1位置是指O-H面外弯曲的振动峰。

图7 壳二糖和壳三糖红外光图谱Fig.7 The IR spectra of chitobiose and chitotriose

2.2.3.41HNMR法分析 采用氢谱核磁法分析制备的壳二糖、壳三糖,参考Sugiyama等[22]对壳寡糖的氢谱的分析,对壳二、三糖单体中结构单元不同位置的氢原子化学位移分析如8A、图8B所示,两者结构极为类似,在各自的结构单元中相同位置的氢原子化学位移基本一致,说明两者有共同的结构单元。与Trombotto等[23]对全脱乙酰化壳寡糖的氢谱分析结果对比,区别在于:壳二糖、壳三糖图谱在δ=1.9 ppm附近都出现了一个双重峰,原因是制备的壳寡糖单体中极少数存在N-乙酰基,该处化学位移代表的是N-乙酰基上甲基质子的化学位移;壳三糖图谱在δ=5.2 ppm附近出现的一个较宽的吸收峰是由N-乙酰氨基葡萄糖还原末端α异头碳上的H质子引起的。

图8 单体的1HNMR谱图Fig.8 The 1HNMR spectrum of monomers

3 结论

本文采用了专一性壳聚糖酶降解壳聚糖,在壳聚糖浓度为5%,酶添加量为10 mg,反应温度为37 ℃,转速120 r/min的条件下,反应120 h可制备出含壳二糖65.63%,壳三糖32.48%的混合物。利用强酸性阳离子交换树脂QY-H003以浓度分别为C1=1.25 mol/L、C2=1.55 mol/L的盐酸为洗脱剂进行梯度洗脱,以柱温T=25 ℃,流速V=2.0 mL/min,上样量为4.22 g的洗脱条件对壳二、三糖混合物进行分离,可获得2个组分,经TLC法、HPLC法、FT-IR法及1HNMR法检测确定了两组分分别为壳二糖、壳三糖。通过HPLC法对两组分进行含量分析,结果表明,壳二糖含量98.06%,壳三糖含量96.00%,采用减重法计算可知壳二糖回收率达92.46%、壳三糖回收率达95.53%。该制备工艺简单,上样量大，制备单体纯度高，产品回收率高。有望实现壳二糖、壳三糖单体规模化生产,能为壳二糖、壳三糖的基础研究应用提供物质保障。

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Monomer preparation and structure analysis of chitobiose and chitotriose

XU Qing1,CHEN Lie-huan2,QIN Zhen1,CHEN Qi-ming1,QIU Yong-jun1,ZHAO Li-ming1,*

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Scienceand Technology,Department of Food Science and Engineering,Shanghai 200237,China;2.Huizhou Long Dragon Biotechnology Co.,Ltd,Huizhou 516000,China)

Chitooligosaccharides has a variety of bioactivities due to its special structure features. Currently,almost all of chitooligosaccharides used in activity research were mixtures of polymers with different degrees of polymerization(DP). In this study,the specific chitosan enzyme was used to degrade chitosan to prepare chitobiose and chitotriose. The TLC analysis was then used to determine the end point of enzymatic hydrolysis reaction,and the component of hydrolysis products were analyzed by HPLC. The results showed that the enzymatic hydrolysates consisted of chitobiose(65.63%)and chitotriose(32.48%).Then,chitobiose and chitotriose were separated by a home-made cation ion exchange resin(QY-H003)with hydrochloric acid solutions at different concentrations(C1=1.25 mol/L,C2=1.55 mol/L). Further analysis was developed by TLC,HPLC,FT-IR and1HNMR.The purity of separated chitobiose and chitotriose were 98.06% and 96.00%,respectively. The recovery rate was 92.46% and 95.53%,respectively. It indicates that the preparation process was suited for scale production of chitobiose and chitotriose with high purity,and it benefits for the future bioactivity studies and applications of chitooligosaccharides.

chitosan;enzymatic hydrolysis;ion exchange chromatography;chitobiose;chitotriose

2017-03-08

徐庆(1989-)，硕士研究生，研究方向：分离提取技术，E-mail:kappa1006@yahoo.com。

*通讯作者:赵黎明(1977-)，博士，教授，研究方向：食品加工技术、分离提取技术，E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn。

国家自然基金项目(31371725);上海市曙光计划(15SG28)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0013-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.003