实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒YMDD变异的临床意义

陈继梅，胡娅娴，戴阳

·论著·

实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒YMDD变异的临床意义

陈继梅1，胡娅娴1，戴阳2

目的：探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎期间发生乙型肝炎病毒HBV YMDD变异情况及其与病毒载量、肝功能的关系。方法:对慢乙肝患者分别检测血清HBV YMDD变异、HBV DNA 载量及肝功能，并对检验结果进行分析。结果:3年间共发生HBV YMDD变异共59例，其中HBV YIDD变异29例(49.15%)，HBV YVDD变异41(69.49%)例，2者共同变异11(18.64%)例，YIDD与YVDD变异比较差异有统计学意义(χ2=5.057，P<0.05)。发生变异的慢乙肝患者HBV DNA阳性率为59/59(100%)，同期对照未发生变异HBV DNA阳性率为40/150(26.67%)，2组比较，差异有统计学意义(χ2=91.34，P<0.05)。发生不同变异各组与未发生变异组病毒载量比较，差异有显著性(组间F=11.175，P<0.05)，而变异组之间HBV DNA之间不存在显著性差异，肝功能仅TBIL结果单独YIDD变异组与未变异组有统计学差异。结论：本地区HBV YMDD变异以HBV YVDD为主；变异各组HBV DNA阳性率及HBV载量都显著高于未变异组，表明YMDD变异株HBV DNA复制活跃。肝功能除了TBIL，变异与否与肝功能水平高低无关，提示不同的HBV YMDD突变模式可能与患者病情无关。

乙型肝炎，慢性； 拉米夫定； HBV YMDD 变异； 实时荧光定量PCR

乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,HBV)的基因复制是利用自身的RNA依赖DNA多聚酶完成的逆转录复制，拉米夫定正是利用此特点做为治疗手段，以乙肝病毒DNA多聚酶作为治疗靶点,来达到抑制病毒复制的目的，是HBV复制强有力的抑制剂。拉米夫定治疗慢乙肝有明确的疗效,但有文献报道长期服用会导致HBV DNA多聚酶活性区核苷酸序列的变异，即酪氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、天门冬氨酸区域变异(YMDD变异)[1]。YMDD变异的发生主要有2种形式,一种为YIDD变异,另一种为YVDD变异。发生变异后,拉米夫定失去结合靶点,严重影响治疗效果,检测YMDD基序变异对及时调整治疗方案、提高疗效有重要的指导意义。本资料采用实时定量PCR技术检测慢乙肝患者拉米夫定用药期间HBV YMDD变异发生情况,使用两条特异性探针同时对YIDD和YVDD变异进行检测。笔者研究了我院近3年期发生YMDD变异慢乙肝患者的59例并对其HBV DNA载量、及肝功能进行对比研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料 全部病例均为我院2013年4月-2016年4月门诊及住院使用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者, 诊断标准依据《2010年慢性乙型肝炎防治指南》(2010年版)[2]。经过检测，3年间我院共检出YMDD变异慢乙肝患者共59例，其中男39例，平均年龄(40.24±13.68)岁；女10例，平均年龄(45.8±8.38)岁。同时选取同期使用拉米夫定治疗未发生YMDD变异的慢乙肝患者150例做为对照，其中男117例，平均年龄(41.74±11.58)岁；女33例，平均年龄(48.18±14.34)岁。

1．2 方法

1.2.1 标本采集 所有患者均空腹采集外周静脉血于红色真空采血管中，同时抽取标本各3 mL 2管，其中1管做肝功能，另1管做HBV YMDD及HBV病毒量检测，及时分离血清并置-20℃保存，1周内测定。

1.2.2 血清HBV载量及YMDD检测 仪器为美国SLAN Real Time PCR Detection System 7300荧光定量检测仪，试剂购自艾康生物有限公司，HBV载量及YMDD检测严格按照说明书操作，同时设置HBV临界阳性对照、HBV强阳性对照、阴性对照及4个标准品，按常规提取HBV DNA，每例患者提取物分别加入A,B,C 3管，A管加入HBV定量反应混合液，B管加入YVDD反应混合液，C管加入YIDD反应混合液。检测荧光选择：定量及YMDD检测(FAM)、内标(VIC)。扩增程序如下:步骤1：1次，温度95℃，时间3 min；步骤2：分别是(1)温度94℃，时间15 s。(2)温度62℃，时间30 s，循环40次。HBV病毒载量(A管)以HBVDNA≥1×103copirs/mL为阳性结果。YMDD变异结果判断标准如下。见表1。

表1 乙型肝炎病毒基因YMDD突变结果判断标准

1．2．3 肝功能生化指标检测 仪器为日立7180全自动生化分析仪，试剂购自温州东瓯津玛生物科技有限公司；质控血清购自英国朗道公司。以血清总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)，胆碱脂酶(CHE)指标作为观察指标。TBIL采用钒酸盐氧化法；ALT,AST,CHE均采用双试剂速率法，室内质控全部在控。

2 结果

2.1 HBV YMDD变异 我院3年间共发生HBV YMDD共59例，其中YIDD变异29例(49.15%)，单独YIDD变异18例(30.51%)，YVDD变异41例(69.49%)，单独YVDD变异30例(50.85%)。YIDD+YVDD 2者共同变异11(18.64%)例, YIDD与YVDD变异经卡方检测χ2=5.057，P<0.05，2者比较差异有统计学意义。显示本地区慢乙肝患者HBV YMDD变异以YVDD为主要变异株。同期做YMDD监测的未发生YMDD变异的慢乙肝患者150人做为对照组，其HBV DNA阳性率为40/150(26.67%)，发生YMDD变异的慢乙肝患者HBV DNA阳性率为59/59(100%)，经卡方检测χ2=91.34，P<0.05。2者比较差异有统计学意义，即发生YMDD变异组HBV DNA阳性率远高于未发生变异组。

2.2 发生变异组与未发生变异组各项检验结果比较 根据变异不同分为单独YIDD、单独YVDD、共同变异、未发生变异等4组，分别统计各组HBVDNA载量及肝功能水平。见表2。

本资料结果显示，发生变异各组与未发生变异组病毒载量(HBVDNA)比较，组间F=11.175，P<0.05，存在显著性差异。单独YIDD变异、单独YVDD变异、共同变异与未发生变异组比较F值分别为0.356，0.303和0.427，P均<0.05，差异有统计学意义。而变异组之间HBVDNA载量比较皆不存在显著性差异。TBIL水平单独YIDD变异与其他各组比较F值分别为13.605，18.345，13.605，P均<0.05，有统计学差异外，其他肝功能结果与是否变异不存在显著性差异，提示不同的HBV YMDD基因突变模式可能与患者肝功能水平高低无关。

表2 变异组与未发生变异组肝功能及病毒载量比较

注：*单独YIDD变异、单独YVDD变异、共同变异与未发生变异组比较F值分别为0.356、0.303和0.427，P均<0.05，▲TBIL水平单独YIDD变异与其他各组比较F值分别为13.605，18.345，13.605，P均<0.05。

3 讨论

我国是乙型病毒性肝炎的大国,全国约有1.3亿慢性HBV携带者,其中约3千万患者存在病毒复制或肝脏炎症，有进一步发展为慢性肝病、肝硬化和肝癌的风险，国际共识认为抗病毒治疗是病原治疗，是控制和预防慢性乙肝病毒感染根本治疗方法。以往的治疗主要依赖干扰素,缺点是治疗效率低,副作用严重。核苷类似物药物主要针对乙肝病毒逆转录酶和乙肝病毒复制，其中具有代表性的、疗效较好的药物主要是拉米夫定,它的全称为2'3'-双脱氧-3'硫代胞嘧啶核苷，又称3-TC。拉米夫定抗病毒的作用机制主要为:在细胞内磷酸化，形成3TC-TP,它是拉米夫定的活性形式，与脱氧胞嘧啶竞争进入合成的DNA链中,阻断病毒DNA的合成；同时具有抑制HBV DNA聚合酶逆转录的活性,抑制HBV复制，降低HBV DNA载量。对大多数乙型肝炎患者的血清HBV DNA检测结果表明，拉米夫定能迅速抑制HBV复制，其抑制作用持续于整个治疗过程，同时使血清氨基转移酶降至正常[3]。拉米夫定只能抑制HBV复制，并不能真正的清除乙肝病毒，同时由于受感染肝细胞内共价闭合环状DNA(cccDNA的)存在和病毒与肝细胞的基因组整合，乙肝病毒感染的彻底根除目前是不可行的[3]，一般须长期用药才能达到临床效果，随着治疗时间的延长，部份慢乙肝患者会发生耐药，经研究发现,此耐药现象同HBV YMDD位点发生基因变异相关[4],导致其编码的HBV多聚酶的YMDD功能区发生突变,称为YMDD变异。最常见的YMDD变异是M(酪氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)取代，即为YVDD或YIDD变异，这两种变异均导致拉米夫定与HBV DNA聚合酶的亲合力下降或消失，失去抑制HBV复制的作用，HBV变异后对乙肝诊断、治疗、预防都产生重大影响[5]。

本文采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对慢性乙型肝炎患者在使用拉米夫定期间YMDD变异进行了监测，同时对患者血清HBV DNA水平及肝功能水平进行了检测。检测结果显示，我院3年间共发生YMDD变异59例，其中YIDD变异29例(49.15%)，单独YIDD变异18例(30.51%)，YVDD变异41例(69.49%)，单独YVDD变异30例(50.85%)。YIDD+YVDD 2者共同变异11(18.64%)例,YIDD与YVDD变异经卡方检测，2者比较差异有统计学意义。显示本地区慢乙肝患者HBV YMDD变异以YVDD为主要变异株，与柳文菊[6]、方立庆[1]检测结果基本一致，与方莉的检测结果[7]不同，对于各地检测结果的不同,方立庆[7]认为HBV基因型/亚型的分布具有明确的地理区域性，不同地区流行的HBV基因型/亚型种类的差异可能就导致了YMDD变异类型具有差异性，这也可能是芜湖地区HBV YMDD变异优势株与部份地区相似与其他地区不同的原因。发生YMDD变异的慢乙肝患者HBVDNA阳性率59/59(100%)，同期做YMDD监测的未发生YMDD变异的慢乙肝患者150人，其HBVDNA阳性率为40/150(26.67%)，2者比较差异有统计学意义，发生YMDD变异组HBVDNA阳性率远高于未发生变异组。发生变异各组与未发生变异组病毒载量比较，差异有统计学意义，单独YIDD变异、单独YVDD变异、共同变异与未发生变异组比较皆存在显著性差异，变异各组HBV载量都显著高于未变异组[8](F值分别为0.356，0.303和0.427，P均为0.000)；变异组HBVDNA之间不存在显著性差异，即变异组之间HBVDNA载量无统计学差异，表明YMDD变异株HBV DNA复制活跃[7]，变异的产生导致了HBV DNA病毒复制的再次活跃，从而导致机体对抗病毒药物的耐药、肝炎症状复发等后果[9]。肝功能除了单独HBV YIDD变异TBIL有统计学差异外，其他肝功能检测差异无统计学意义。肝功能除了TBIL，变异与否与肝功能水平高低无关，显示YMDD变异株导致肝功能损伤的相关性较弱，提示不同的HBV YMDD基因突变模式可能与患者病情无关[10]。

本资料结果显示，YMDD变异不但使慢乙肝患者病毒阳性率明显提高,患者100%出现HBV DNA阳转，而且变异组病毒载量水平显著高于未变异组，YMDD变异株HBV DNA复制活跃,这部分患者则可能不适用于拉米夫定继续治疗[11]。因些，在拉米夫定治疗期间应严密监测YMDD变异及HBV病毒量及肝功能，以便及时发现YMDD变异及病情严重变化，对出现变异的患者及时调整用药，从而达到最佳的治疗效果。

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Clinical significance of YMDD mutations of HBV detected by quantitative real-time PCR

CHEN Ji-mei,HU Ya-xian,DAI Yang.

(Wuhu Third People's Hospital, Anhui 241000, China)

Objective:To explore the status of YMDD mutations of HBV during lamivudine antiviral therapy of hepatitis B and its associations with HBV viral load and liver function.Methods:Serum HBV YMDD mutations, HBV viral load and liver functions were detected and analyzed from chronic hepatitis B patients visiting Wuhu Third People's Hospital from April 2013 to April 2016.Results:Totally 59 cases of HBV YMDD mutations occurred during the 3-year investigation, which included 29 YIDD mutations (49.15%),41 YVDD mutations (69.49%) and 11 YIDD/YVDD dual mutations (18.64%). The difference between YIDD mutations and YVDD mutations was significant (X2=5.057，P<0.05).The positive rate of HBV DNA of hepatitis B patients with YMDD mutations was 100% (59/59), whereas for those in controls without YMDD mutations, the positive rate of HBV DNA was 26.67% (40/150). There was significant difference between the 2 groups (X2=91.34，P<0.05). In comparison of HBV viral loads between the group without mutations and the groups with diverse mutations, the difference was significant (inter-groupsF=11.175,P<0.005), and no difference were found among groups with mutations. In addition, among parameters of liver function, only TBIL results exhibited difference between YIDD mutation group and negative control group. Conclusion:In Wuhu city, the majority of HBV YMDD mutations are YVDD ones.HBV DNA positivity and HBV viral load in mutation groups are significantly higher than in the negative control group, which indicates that active replication of HBV DNA is present in HBV variants with YMDD mutations. Except for TBIL, other liver function parameters have no associations with YMDD mutations, which hints that different modes of HBV YMDD mutations are independent of progression of chronic hepatitis B.

Hepatitis B,chronic; Lamivudine; HBV YMDD mutation; Real-time PCR

安徽省芜湖市第三人民医院 1.检验科;2.传染科, 241000

陈继梅(1970-)，女，副主任技师，大学。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.04.007

R 512.62

A

1008-7044(2017)04-0398-04

2017-03-17)