鞘氨醇激酶（SphK1）基因敲除小鼠的饲养繁育及基因鉴定

李昌正杨桂智颜思珊李锐兰天，

鞘氨醇激酶（SphK1）基因敲除小鼠的饲养繁育及基因鉴定

李昌正1杨桂智1颜思珊2李锐2兰天1，2

目的 通过对鞘氨醇激酶（SphK1）基因敲除小鼠的繁殖和鉴定，以提供SphK1缺失对各种疾病的影响的相关理想动物模型。方法将从美国国立健康研究院（National Institute of Health，NIH）处引进的SphK1敲除杂合子小鼠进行交配，获得子代小鼠后，提取小鼠尾部的DNA，用琼脂糖电泳等方法检测及验证子代小鼠基因型。结果 获得纯合子子代小鼠。结论 SphK1基因敲除小鼠的鉴定获得成功。

SphK1；基因敲除小鼠；动物模型

鞘氨醇激酶（Sphingosine kinase，SphK）作为催化1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate，S1P）[1-3]生成的关键限速酶，具有SphK1和SphK2两个亚型，虽然二者结构域上高度保守，但他们在亚细胞定位、酶催化特性和组织表达谱上均有显著不同；其中SphK1可以促进细胞增殖和抑制凋亡[4-5]。近来研究表明：SphK信号通路与多种人类疾病[6-9]密切相关。由于基因工程小鼠具备在动物整体水平上模拟特定基因在体内的功能等一系列优点，因此本实验室在前期各项科学研究的基础上，引进了SphK1基因敲除杂合子小鼠，同时成功对SphK1小鼠进行了繁殖和鉴定，进一步研究SphK1在各类疾病的发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SphK1基因敲除小鼠从美国国立健康研究院（National Institute of Health，NIH）引进，其品系背景为C57BL/6J，雌性小鼠与雄性小鼠各2只，基因型为SphK1杂合子（ SphK1+/-）。

1.2 主要试剂

基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix购自Thermo；DL1000 bp DNA marker购自takara；琼脂糖粉购自生工生物工程（上海）股份有限公司；苏木素，伊红购自北京鼎国生物科技有限公司。

1.3 基因敲除小鼠的饲养和繁殖

将小鼠在SPF环境中饲养，温度稳定在22～26℃，湿度50%～65%。饲养过程中，需每日观察小鼠的生长发育及是否受孕状况，并将小鼠分娩时间具体记录。小鼠的繁殖具体操作为：将6～8周龄的小鼠以雌性小鼠2只和雄性小鼠1只的比例同笼合养，并定期给予灭菌葵花籽补充营养。雌性小鼠的妊娠期为19～21 d，哺乳期为18～21 d，哺乳期满的子代鼠要和母鼠分开，雌性小鼠与雄性小鼠分笼饲养。

1.4 琼脂糖电泳及基因型鉴定

图1 子代SphK1小鼠PCR鉴定结果

从4℃冰箱中取出PCR产物，取5 μl在3% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析，产物大小为350 bp为纯合子小鼠；大小在300 bp为野生型小鼠；2条电泳条带均存在的为杂合子小鼠。PCR反应引物由上海生工公司合成。引物1∶ TGTCACCCATGAACCTGCTGT CCCTGCACA 位于替换的基因片段，用于检测突变型；引物2∶AGAAGGCACTGGCTCCTCCAG AGGAACAAG位于SphK1基因敲除区域，用于检测野生型；引物3∶ TCGTGCTTTACGGTATCGCCG CTCCCGATT 则作为通用引物。PCR反应程序为∶ 预变性94℃，7 min；变性94℃，1 min；退火65℃，1 min；延伸72℃，1 min；反应35个循环，4℃保存。

1.5 Western Blot验证SphK1基因敲除效果

把组织剪切成细小的碎片，按照每20 mg组织加入400 μl裂解液的比例加入裂解混合液（RIPA 和蛋白酶抑制剂PMSF），液氮研磨。吸取研磨液置于1.5 ml的EP管中，离心（4℃，12 000 rpm /min，20 min） 吸取上清。BCA法定量后的蛋白样品经十二烷基磺酸钠（SDS） ——聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，电转至PVDF膜上。PVDF膜用5% 脱脂奶粉摇床封闭1 h，1×TBST洗膜3次/10 min，SphK1抗体4 ℃孵育过夜，次日用1×TBST洗膜3次/10 min，辣根过氧化物标记抗兔来源的二抗室温孵育1～2 h，1×TBST洗膜3次/10 min，化学发光显色，以凝胶成像系统拍片。

2 结果

2.1 部分小鼠基因型鉴定结果

3%琼脂糖凝胶电泳分析显示，SphK1杂合子的PCR扩增产物的大小为300 bp与350 bp， SphK1-/-的PCR扩增产物的大小为300 bp（如图1）。

2.2 SphK1-/-纯合子与WT小鼠中SphK1蛋白表达量的比较

Western Blot实验结果显示（如图2），SphK1小鼠与WT小鼠相比，SphK1蛋白的表达量明显下调且趋近于不表达。

图2 SphK1-/-纯合子与WT小鼠中SphK1蛋白的表达

3 讨论

基因敲除是通过特定的途径使特定的基因失活或缺失的一种新型分子生物学技术。该技术采用基因结构或功能缺失的小鼠来研究相应基因及相关疾病，能降低甚至排除其他内源性基因的干扰，实验结果可信度高。

为能更好的研究SphK1在各种疾病发生发展中的作用及其相关分子机制，我们在SphK1基因敲除小鼠成功引进后，成功进行了SphK1小鼠的一系列繁殖与鉴定，由于杂合子小鼠与纯合子小鼠相比，其表型较不明显，不利于后续的研究，因此本研究希望通过繁殖获得大量SphK1敲除小鼠，以获得尽可能多的纯合子小鼠。同时，由于引进SphK1敲除小鼠为杂合子，根据孟德尔遗传定律，其子代可能出现3种基因型，即纯合子（ SphK1-/-） 、杂合子（ SphK1+/-）、野生型（ SphK1+/+） ，其比例接近1：2：1，故必须对它们进行基因型鉴定；其中，繁殖子代的纯合子可以用作实验组，野生型可以用作对照组，为后续的研究提供了理想可靠的动物模型。

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Reproduction and Genotype Identification of Sphingosine Kinase 1 (SphK1) Knockout Mice

LI Changzheng1YANG Guizhi1YAN Sishan2LI Rui2LAN Tian1,21 School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou Guangdong 510006, China; 2 College of Pharmacy

Objective To provide an ideal animal model for the effect of SphK1 deletion on various diseases by the propagation and identification of sphingosine kinase (SphK1) knockout mice. Methods Heterozygote mice from NIH were bred and reproduced. Genome DNA was extracted from the murine tail and identified by agarose gel electrophoresis. Results SphK1 genotypes of the offspring mice included homozygous( SphK1-/-). Conclusion SphK1 knockout mice are successful reproduced.

SphK1; gene knockout mouse; animal model

Q343．1

A

1674-9316（2017）14-0131-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．14．073

广东省自然科学基金重点项目（2016A030311014）

1广东药科大学基础学院，广东 广州 510006；2药学院通信作者：兰天