伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

武吉强，徐晶晶，童 武，王 涛，叶 超，郑 浩，单同领，童光志,2，李国新,2

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

·研究论文·

伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

武吉强1，徐晶晶1，童 武1，王 涛1，叶 超1，郑 浩1，单同领1，童光志1,2，李国新1,2

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

为制备伪狂犬病病毒变异株gE蛋白的单克隆抗体，PCR扩增伪狂犬病病毒gE蛋白主要抗原表位区的基因片段，并将其克隆至原核表达载体pCold-TF。经1 mmol/L IPTG低温诱导，表达了约90 kDa的gE融合蛋白。融合蛋白用镍离子金属亲和层析柱纯化后，免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，经细胞融合和筛选，获得了2株稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（5B2和6E6）。间接免疫荧光试验（indirect immunof uorescence assay，IFA）显示2株单克隆抗体均能与PRV变异株（JS-2012）反应，但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株无反应。Western blot结果显示5B2和6E6与gE蛋白不反应，提示2株单克隆抗体针对的可能是gE蛋白的构象表位。本研究获得的gE蛋白单克隆抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定与功能研究以及野毒株和疫苗株的鉴别诊断提供了良好的工具。

伪狂犬病毒；变异株；gE蛋白；单克隆抗体

伪狂犬病（pseudorabies，PR），是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起多种动物发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种急性烈性传染病，又称Aujeszky's病[1,2]。PRV属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科成员，双链线状DNA病毒。猪是该病原的主要宿主和传染源，成年猪大多为隐性感染，仔猪发病主要表现为发热，食欲不振，精神萎靡，伴有明显的神经症状。妊娠母猪感染会导致流产，产死胎及木乃伊胎[3]。随着养殖业的规模化发展，该病的发生及流行日趋严重，症状愈发明显[4]。该病也给全世界养猪业带来了极大的经济损失。

伪狂犬病毒的gE基因位于US区，全长1.7 kb，是伪狂犬病毒的主要毒力基因之一[5]。伪狂犬病自我国发现以来一直在猪群中流行，gE基因缺失活疫苗的广泛使用使得该病得到了有效控。但由于伪狂犬病有着高度的潜伏感染特性，易在体内外环境变化的应激下爆发疫情[6]。gE-ELISA配合gE基因缺失疫苗使用，能用血清学方法鉴别出疫苗接种猪和野毒感染住，对于伪狂犬病的防控与净化具有重要意义。随着2011年伪狂犬病在中国爆发[7,8]，伪狂犬病毒毒力增强，传统疫苗不能对新出现的变异毒株提供完全保护，这提示单纯使用疫苗不可能根除伪狂犬病[9]。为了有效控制直至根除伪狂犬病，需建立一种有效快速的血清学诊断方法以区分野毒株感染猪与疫苗免疫猪。本研究研制了针对伪狂犬病毒变异株gE蛋白的单克隆抗体，这为伪狂犬病病毒变异株的鉴定、及建立血清学鉴别诊断方法奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞和实验动物 伪狂犬病病毒JS-2012株，Bartha-K61株，SP2/0骨髓瘤细胞，PK-15细胞，Vero细胞均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。

1.2 载体、试剂和菌株 pCold-TF载体，大肠杆菌BL21（DE3）购自TaKaRa（上海）公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG、FITC标记的山羊抗鼠IgG和FBS购于Sigma（上海）公司；核酸内切酶EcoR I购自NEB（上海）公司。

1.3 pCold-gE重组质粒的构建 根据NCBI发表的PRV（JS-2012）gE基因序列（序列号：KP257591.1），设计特异性引物扩增gE基因第151~750位核苷酸。gE-F：5'-accctcgagggatccgaattcATGACCGAGGCCG ACGAC-3'，gE-R：5'-caggtcgacaagcttgaattcTTAG ACCACGCGCGGCAT-3'。小写核苷酸为与pCold-TF进行同源重组的同源臂序列，扩增产物为600 bp。按照天根DNA小量提取试剂盒说明书提取PRV（JS-2012）DNA（-20℃保存），用PrimeSTAR HS（TaKaRa）高保真酶扩增。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；98℃变性10 s，68℃退火10 s，72℃延伸1 min（35个循环）；72℃延伸10 min。将PCR产物通过同源重组（诺唯赞）的方法，与pCold-TF载体多克隆位点的相应位置重组，质粒测序正确后，阳性质粒命名为pCold-gE。

1.4 重组蛋白的诱导表达与纯化 将重组质粒pColdgE转化到BL21（DE3）大肠杆菌中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6~0.8时，加入终浓度为1 mmol/ L的IPTG诱导，16℃振荡24 h。收集菌体加入PBS进行超声裂解，加入5×SDS buffer煮沸10 min后进行SDS-PAGE电泳，对SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况，同时设置空载体表达组作为对照。之后将pCold-gE转化表达菌按1:1000比例接种到4 mL含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37℃、200 r/min振荡培养12 h。然后再按1:100将复苏的菌液接种于100 mL含100 μg/mL Amp的LB培养液中，37℃、200 r/min培养，至OD600达到0.6~0.8时停止，加入终浓度为1 mmol/L IPTG，16℃诱导24 h后，离心收集菌体。表达后的菌体进行超声破碎，差速离心后收集上清蛋白。采用带His标签的磁珠（Biotool）根据说明书进行纯化，纯化的蛋白分装后保存于-80℃。

1.5 小鼠免疫 取100 μg纯化蛋白与弗式完全佐剂1:1混合乳化，接种6周龄健康雌性BALB/c小鼠，此后每隔2周用等量纯化蛋白与弗氏不完全佐剂乳化进行第二和第三次免疫，第三次免疫后第10天采血，测定ELISA抗体效价，效价在1:10000以上的小鼠，在细胞融合前3~4 d经腹腔注射纯抗原200 μg，进行加强免疫。

1.6 McAbs的制备 融合前1 d取小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，之后选取免疫效价最高的小鼠进行脾细胞与SP2/0细胞融合。将杂交瘤细胞培养在铺有饲养层细胞的96孔板里，于37℃、5% CO2在HAT选择性培养基条件下培养。在杂交瘤细胞长满96孔板1/3~1/2面积时，通过间接ELISA、IFA方法检测来筛选阳性细胞克隆株。将筛选的阳性细胞克隆株经3~5轮细胞亚克隆之后，对能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，液氮冻存。将筛选的杂交瘤细胞株连续传代20代，分别取第5、10、15和20代细胞上清液，用间接ELISA的方法进行检测，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体稳定性。

1.7 间接免疫荧光试验检测单克隆抗体 将Vero细胞铺在12孔板中，1 MOI PRV感染18 h后，弃去上清后，用PBS洗3遍，用丙醇在-20℃固定细胞20 min，5% BSA室温封闭1 h，PBS洗板之后加入收集的杂交瘤细胞上清液，室温孵育1 h。PBS洗3遍，避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:800 PBS稀释）室温避光孵育1 h。在荧光显微镜下观察荧光。

1.8 Western blot检测单克隆抗体 将PRV（JS-2012）病毒感染Vero细胞，12 h后用细胞裂解液裂解细胞，收取细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳。使用Trans-Blot® SD cell system （BIO-RAD，USA）转印NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用1:500稀释的杂交瘤细胞上清4℃孵育10 h，TBST洗膜3次后，20 min/次。加入1: 5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温反应1 h，TBST洗膜后，经过发光、曝光、显影、定影之后扫描图片。

2 结果

2.1 pCold-gE重组质粒的构建 PCR扩增得到了伪狂犬病毒gE基因片段，大小约600 bp（图1A），将目的片段纯化回收并克隆到pCold-TF表达载体中。重组质粒酶切鉴定结果显示，阳性质粒出现与预期大小一致的片段（图1B）。测序结果显示阳性质粒携带目的基因与预期序列一致，阳性质粒pCold-gE可以用于下一步的试验研究。

图1 gE基因扩增和重组质粒pCold -gE酶切鉴定Fig.1 Amplif cation of gE gene and identif cation of recombination plasmid pCold-gE by restriction enzymes digestionA: gE基因的PCR扩增. 1: gE基因 PCR扩增结果; 2:阴性对照; M: DNA分子量标准(DL2000)B: 重组质粒pCold-gE酶切鉴定. 1: pCold-TF; 2: pCold-gE; M: DNA分子量标准(DL2000)A: PCR amplif cation of gE gene. 1: PCR amplif cation result of gE gene; 2: Negative control; M: DNA Marker(DL2000)B: Identif cation of recombination plasmid pCold-gE by restriction enzymes digestion. 1: pCold-TF; 2: pCold-gE; M: DNA Marker(DL2000)

2.2 重组gE蛋白的表达纯化 pCold-gE载体转化的表达菌E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导后，收集菌体超声裂解进行SDS-PAGE凝胶检测。结果显示，与载体对照组相比，pCold-gE表达菌出现了相对分子量约为90 kDa（TF辅助蛋白约60 kDa）的目的条带，与重组蛋白大小相符。目的蛋白主要都在裂解物上清中。重组蛋白经磁珠纯化后，电泳结果显示纯化目的蛋白纯度较高（图2）。

2.3 间接免疫荧光试验检测gE单克隆抗体的特异性

以1 MOI PRV（JS-2012株或Bartha-K61株）感染Vero细胞24 h，固定细胞进行间接免疫荧光试验，以检测单克隆抗体与不同毒株的特异性反应。结果显示，2株单克隆抗体均能与PRV JS-2012毒株反应，而不与Bartha-K61毒株反应，也不与Vero细胞发生反应（图3）。

图2 纯化前后的gE重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purif cation of recombinant gE protein1: 纯化的重组gE蛋白; 2: IPTG诱导的pCold-gE转化菌裂解物上清; 3: IPTG诱导的pCold-gE转化菌裂解物沉淀; 4: IPTG诱导的pCold -TF转化菌; M:蛋白质分子量标准1: Purif ed fusion gE protein; 2: Supernatant of lysate of pColdgE induced by IPTG; 3: Pallet of lysate of pCold-gE induced by IPTG; 4: pCold -TF induced by IPTG; M: Protein Marker

图3 IFA鉴定gE蛋白单克隆抗体的特异性Fig.3 Identif cation of anti-gE McAbs by IFA

2.4 Western blot检测gE单克隆抗体的特异性 以1 MOI PRV（JS-2012株或Bartha-K61株）感染Vero细胞24 h，收集细胞后，用Western blot方法检测单克隆抗体与不同毒株的特异性反应。结果显示，2株单克隆抗体均不与JS-2012毒株发生反应（图略）。

3 讨论

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的一种烈性传染病，该病在世界大部分地区流行。为了彻底净化伪狂犬病，许多国家实施了根除计划[10,11]。而gE基因缺失疫苗的广泛的应用使控制和消灭该病是成为可能。2011年以来，我国发生了由伪狂犬病病毒变异株引起的猪伪狂犬病，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。2012年，我们分离到1株PRV变异毒株（JS-2012株），与经典强毒株相比，该变异毒株致病力明显增强，基因序列发生了改变，主要毒力基因gE也发生了改变[7]。伪狂犬病潜伏感染能力强，能够有效区分疫苗免疫猪与野毒感染猪的血清学检验方法是净化甚至根除PR的重要手段。目前，检验gE抗体的商品化试剂盒已有多种。本研究研制的抗伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体，与PRV具有良好的反应性，可以用来研制具有自主知识产权的检测gE抗体的试剂盒。

gE基因是PRV主要毒力基因之一，也是基因缺失疫苗的靶基因。gE基因位于基因组的US区，全长1.7 kb，是病毒的糖蛋白之一，由N端的胞外区，中间的跨膜区及C端的胞内区组成[12]。PRV gE蛋白已经鉴定出的6个抗原表位中，有5个位于N端的52~238位氨基酸之间[13,14]。本研究表达的gE蛋白（第150~750位氨基酸）包含了上述5个抗原表位。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，本研究获得的2株单克隆抗体（5B2和6E6）均能与PRV变异株（JS-2012）反应，但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株无反应。Western blot结果显示，5B2和6E6均不能与PRV（JS-2012株）gE蛋白反应。上述结果提示，5B2和6E6单克隆抗体针对的可能是gE蛋白的构象表位，这与本研究表达的融合蛋白具有良好的可溶性密切相关，融合蛋白可能形成了简单的构象结构。总之，上述2株单克隆抗体均具有建立检测gE抗体的检测方法的潜力。

本研究利用pCold-TF表达载体表达了伪狂犬病病毒gE可溶性融合蛋白，并制备了2株特异性单克隆抗体。这些抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定及建立相应的gE抗体检测方法奠定了良好的基础。

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GENERATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST GE PROTEIN OF PSEUDORABIES VIRUS VARIANT STRAIN

WU Ji-qiang1, XU Jing-jing1, TONG Wu1, WANG Tao1, YE Chao1, ZHENG Hao1, SHAN Tong-ling1, TONG Guang-zhi1,2, LI Guo-xin1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The gene encoding the key antigenic epitope regions of gE of pseudorabies virus (PRV) was amplif ed in PCR and inserted into the pCold-TF expression vector. Expression of the recombinant fusion protein about 90 kDa was observed under 1mmol/L IPTG environment. The recombinant gE protein purified with nickel ion metal affinity chromatography was used to immunize 6-week-old BALB/c female mice for the preparation of monoclonal antibodies (McAbs). Two hybridoma cell lines (5B2 and 6E6) were obtained for stably producing anti-gE protein McAb. These two McAbs reacted with PRV variant strain (JS-2012) but not with the gE deleted vaccine virus Bartha-K61 strain in indirect immunof uorescence assay（IFA). Western blot results showed that 5B2 and 6E6 did not reactwith PRV(JS-2012). The results indicated that 5B2 and 6E6 might be against confomational epitope of gE. These specif c monoclonal antibodies might provide a good tool for the development of PRV diagnostic method.

Pseudorabies virus; variant strain; gE protein; monoclonal antibodies

S852.659.1

A

1674-6422（2017）03-0023-05

2017-03-08

上海市闵行区人才发展专项基金；上海市自然科学基金项目（14ZR1448900)；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2015）第1-7号, 沪农科攻字（2016）第4-2号）；国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36）

武吉强，男，硕士研究生，预防兽医学专业

李国新，E-mail：guoxinli@shvri.ac.cn