补肾活血方亲脂性组分的气相色谱分析及诱导成骨细胞分化研究

钱亚芳++单乐天+++金红婷+++谷满仓

[摘要] 目的 建立补肾活血方亲脂性组分的气相色谱测定方法，研究该组分诱导成骨细胞分化的活性。 方法 采用超临界流体萃取补肾活血方中亲脂性组分SFEⅠ和SFEⅡ，气相色谱法测定其中亚油酸和油酸含量；研究SFEⅠ和SFEⅡ含药血清诱导小鼠成骨细胞MC3T3E1增殖和碱性磷酸酶活性的能力。 结果 亚油酸甲酯与油酸甲酯在0.2～1.2 μg范围内呈良好线性关系，方法学考察结果符合要求；SFEⅠ的亚油酸和油酸含量分别为318.51～328.64 mg/g和454.25～460.82 mg/g，SFEⅡ的亚油酸和油酸含量分别205.22～211.32 mg/g和228.55～235.13 mg/g。体外研究显示，SFEⅠ与SFEⅡ组含药血清可显著提高成骨细胞MC3T3E1增殖率和碱性磷酸酶活性，且强于醇水提取物组（P < 0.05）。 结论 补肾活血方超临界流体萃取物SFEⅠ和SFEⅡ以亞油酸和油酸为主，且诱导成骨细胞分化活性优于醇水提取物。

[关键词] 补肾活血方；超临界流体萃取；气相色谱法；成骨细胞增殖；碱性磷酸酶活性

[中图分类号] R289 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（b）-0008-04

Gas chromatograph quantification and osteoblast cells stimulation study on lipophilic products from Bushen Huoxue Recipe

QIAN Yafang1，2 SHAN Letian3 JIN Hongting3 GU Mancang2

1.Preparation Center， Zhejiang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Province， Hangzhou 310006， China； 2.College of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Province， Hangzhou 310053， China； 3.Institute of Orthopaedics and Traumatology， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Province， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To establish determination method of lipophilic components in Bushen Huoxue Recipe by gas chromatography（GC）， and investigate the activity of this component to induce osteoblast differentiation. Methods Multiply supercritical fluids were employed to extract lipophilic products SFEⅠ and SFEⅡ from Bushen Huoxue Recipe. Linoleic acid and oleic acid were determined by GC. The proliferation and ALP activity of osteoblast cells were explored after exposure to drug-loaded serums from SFEⅠ and SFEⅡ treated rats. Results Methyl linoleic acid and methyl oleic acid had good linear relationship within the inlet range of 0.2-1.2 μg. Methodological findings met the requirements. Linoleic acid and oleic acid content of SFEⅠ were 318.51-328.64 mg/g and 454.25-460.82 mg/g. Linoleic acid and oleic acid content of SFEⅡ were 205.22-211.32 mg/g and 228.55-235.13 mg/g. The drug-loaded serum from SFEⅠ and SFEⅡ treatment group could significantly stimulate the proliferation and ALP activity in MC3T3E1 cells in vitro compared with that of ethanol-water extraction groups （P < 0.05）. Conclusion The supercritical fluid extracts of Bushen Huoxue Recipe SFEⅠ and SFEⅡ are mainly linoleic acid and oleic acid， and the osteoblast differentiation activity is better than that of alcohol extract.

[Key words] Bushen Huoxue Recipe； Supercritical fluids extraction； Gas chromatograph method； Osteoblast cells proliferation； Alkaline phosphatase activity

临床与基础研究表明，脂质及其体内代谢产物与骨组织的生长、代谢与重建密切相关[1-2]。其中油酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）直接参与了骨合成代谢相关激素的体内转化，进而影响骨代谢[3-5]。补肾活血方是浙江省中医院治疗骨质疏松症的临床有效方剂[6-7]，药理研究表明其可提高去卵巢制骨质疏松症大鼠的骨密度和骨强度[8]。本研究建立了气相色谱技术定量检测补肾活血方超临界流体萃取所得亲脂性组分SFEⅠ和SFEⅡ中主要PUFA含量的方法，并研究SFEⅠ与SFEⅡ对小鼠成骨细胞MC3T3E1细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响。

1 材料与试剂

HA220-50-01超临界流体萃取仪（江苏南通华安超临界萃取有限公司），Agilent 6890气相色谱仪（Agilent公司），SkanIt 4.0多功能酶标仪（Thermo-fisher公司），倒置显微镜（Olympus公司），CO2培养箱（Thermo公司）。

SD大鼠，6周龄，清洁级，雌雄各半，体重（200±20）g，购自浙江中医药大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK（沪）2013-0016。实验所需中药饮片购自浙江中医药大学中药饮片厂。仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂医药有限公司，批号1407019）；α-MEM培养基、胎牛血清素（Gibco公司）；PBS缓冲液，胰酶和青/链霉（杭州吉诺生物科技有限公司）；碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）油酸甲酯（货号75160）、亚油酸甲酯（货号L1876）、十七烷酸甲酯对照品（货号51633）及二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）；正己烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 补肾活血方超临界流体萃取物的制备

参照课题组前期发表论文方法[9]，取中药饮片熟地、杜仲、白附片、枸杞、肉桂、山茱萸、桃仁、红花、山药、炙甘草，粉碎成最粗粉，按处方比例混合均匀，准确称取适量，置于超临界萃取仪萃取釜内。萃取条件如下：萃取釜压力23 MPa、萃取釜温度38℃、分离器压力7 MPa、分离器温度50℃，以CO2超临界流体萃取4 h，从分离器中得萃取物SFEⅠ。萃取剩余物料在萃取釜压力25 MPa、萃取釜温度38℃、分离器压力6 MPa、分离器温度45℃的条件下，以含2%乙醇的CO2超临界流体萃取4 h，从分离器中得萃取物SFEⅡ。

2.2 油酸与亚油酸含量测定方法[10]

2.2.1 气相色谱条件与系统适应性 色谱柱：HP-INNOWax-PEG色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm），载气N2，流速1.0 mL/min，进样口温度210℃，柱温190℃，保持25 min，FID检测器，检测器温度：210℃，分流比：20∶1，进样量：1.0 μL，分离度应>1.5，理论板数以油酸甲酯和亚油酸甲酯峰计应>3000。

2.2.2 对照品供试液制备 分别精密移取油酸甲酯、亚油酸甲酯照品和十七烷酸甲酯对照品（内标），正己烷定容至2 mL，即得对照品供试液（分别含油酸甲酯和亚油酸甲酯0.2 mg/mL，内标0.1 mg/mL），4℃保存。

2.2.3 样品供试液制备 精密称取SFEⅠ与SFEⅡ 30 mg，加0.5 mol/L氢氧化钾甲醇溶液2 mL，充N2，65℃水浴中皂化15 min，加三氟化硼甲醇溶液2 mL，65℃甲酯化2 min，精密加正己烷4 mL，振摇，加饱和氯化钠溶液至刻度，充N2，静置待分层，精密吸取上层液1.0 mL，加内标贮备液0.5 mL，正己烷定容，即得，4℃保存。

2.2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液、过0.45 μm滤膜，供试品溶液1.0 μL，注入气相色谱仪，测定，以内标法计算，即得。

2.3 方法学考察[11]

2.3.1 线性关系考察 精密移取对照品供试液适量，正己烷定容，制备油酸甲酯与亚油酸甲酯浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的一系列对照品工作液，取0.2 μL后注入气相色谱仪，记录峰面积。以对照品的浓度（mg/mL）为横坐标，对照品和内标物峰面积的比值为纵坐标，考察线性关系。

2.3.2 稳定性试验 取供试品溶液，每隔2 h测定1次，计算对照品峰面积与内标峰面积比值，计算RSD值。

2.3.3 重复性试验 取同一供试品溶液进行3次平行测定，计算油酸甲酯与亚油酸甲酯平均含量以及RSD值。

2.3.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品供试品适量，精密加入对照品储备液适量，使油酸甲酯与亚油酸甲酯量为供试品中相应物质量的80%、100%与120%，注入气相色谱，测定油酸甲酯与亚油酸甲酯含量，计算回收率。

2.4 細胞培养

小鼠成骨细胞MC3T3E1常规贴壁生长，传代培养于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的α-MEM完全培养液中，37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育，2 d换液，3 d传代1次。

2.5 含药血清制备

含药血清制备方法所有动物按体重随机分为11组，每组3只：空白血清对照组，仙灵骨葆胶囊阳性对照组，补肾活血方SFEⅠ和SFEⅡ以及醇水提物低、中、高剂量组（分别相当于12.5、25、50 g生药/kg体重），连续灌胃3 d，参考课题组前期发表论文方法制备含药血清[12]。

2.6 成骨细胞增殖实验（MTT）法

取对数生长期成骨细胞MC3T3E1，按3×104/mL接种于96孔培养板，孵育过夜。将各组含药与空白对照组血清加入各细胞培养孔，使血清终浓度为2%，设立不含细胞的对照孔。放回培养箱孵育48 h，按MTT法要求操作，490 nm下测定吸光度（OD），计算成骨细胞净增殖率。成骨细胞净增殖率=[（含药血清处理孔OD-溶剂对照孔OD）-（空白血清处理孔OD-溶剂对照孔OD）]/（空白血清处理孔OD-溶剂对照孔OD）×100%。

2.7 碱性磷酸酶活性实验（pNPP）法

按“2.6”项下方法操作，吸取各孔培养液，小心用PBS洗涤一次，按碱性磷酸酶检测试剂盒要求操作，同时制作标准曲线，在405 nm测定各孔OD，计算各孔碱性磷酸酶活性。

2.8 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 气相色谱图及线性关系

气相色谱图见图1，结果显示十七烷酸甲酯、亚油酸甲酯和油酸甲酯色谱峰分离度良好，样品检测无干扰。亚油酸回归方程为y=0.6774x-0.2596（R=0.9993），油酸回归方程为y=1.4151x-0.5080（R=0.9991），亚油酸甲酯与油酸甲酯进样量在0.2～1.2 μg范围内呈现良好线性关系。

3.2 方法学考察结果

重复性考察结果萃取物中亚油酸甲酯与油酸甲酯平均含量分别为221.6 mg/g（RSD=1.88%）和246.4 mg/g（RSD=1.51%）；稳定性考察结果亚油酸和油酸24 h内峰面积比变化值的RSD分别为1.14%和2.26%；加样回收结果萃取物中亚油酸与油酸的平均加样回收率分别为98.89%（RSD=2.33%）和97.79%（RSD=2.39%）；方法学考察各项指标均符合要求。

3.3 萃取物中亚油酸、油酸含量测定结果

分别取三批萃取物SFEⅠ和SFEⅡ的样品，测定其中亚油酸甲酯与油酸甲酯含量，根据相对分子质量换算得到样品中亚油酸和油酸的含量，由表1可知亚油酸与油酸质量之和约占SFEⅠ和SFEⅡ总质量的78.8%与44.5%。

3.4 萃取物诱导细胞增殖活性结果

补肾活血方萃取物SFEⅠ中、高剂量组，SFEⅡ各剂量组和醇水提取物高剂量组含药血清诱导细胞增殖率显著高于空白血清对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。SFEⅠ中剂量组、SFEⅡ低剂量组含药血清诱导细胞增殖率显著高于补肾活血方醇水提取物相应剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.5 萃取物诱导细胞碱性磷酸酶活性结果

补肾活血方萃取物SFEⅠ、SFEⅡ和醇水提取物各剂量组含药血清诱导细胞碱性磷酸酶活性均显著强于空白血清对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。SFEⅠ中、高剂量组及SFEⅡ低、中、高剂量组含药血清诱导胞浆碱性磷酸酶活性作用显著强于醇水提取物相应剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

4 讨论

补肾活血方以右归饮加桃仁、红花组成，临床用于治疗因肾阳不足、血瘀内停所致的骨质疏松症患者。本课题组前期采用醇水双提法精制得到补肾活血颗粒，经动物实验证明其可激活成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路[13]，并抑制破骨细胞整合素αVβ3表达[14]，提高骨密度和骨强度[15]。然而该方中不乏桃仁、肉桂等富含亲脂性和挥发性组分的药味，传统的醇水双提法仅能富集复方中水溶性和极性组分[16]。流行病学研究已经证明，PUFA摄入量与人体的骨密度呈正相关[17-18]；动物实验表明PUFA可提高去卵巢大鼠的骨量和骨密度[19-20]。为研究补肾活血方中的亲脂性组分的化学组成及其诱导成骨细胞分化的能力，本研究建立了气相色谱分析补肾活血方多元超临界流体萃取物SFEⅠ和SFEⅡ中主要PUFA组成——油酸与亚油酸含量的方法，含量测定表明油酸与亚油酸为SFEⅠ和SFEⅡ中的主要成分。血清药理学研究显示，SFEⅠ和SFEⅡ组含药血清可显著诱导成骨细胞前体MC3T3E1增殖，并显著增强细胞碱性磷酸酶活性，且作用强于醇水提取物组。本研究结果表明，补肾活血方经超临界流体萃取所得的亲脂性组分也可能具有治疗骨质疏松症的潜力，但需进一步的药效学实验证明。

[参考文献]

[1] Longo AB，Ward WE. PUFAs，bone mineral density，and fragility fracture：findings from human studies [J]. Adv Nutr，2016，7（2）：299-312.

[2] Raewyn CP，Paul JM，Marlena CK. Long-chain polyunsaturated fatty acids and the regulation of bone metabolism [J]. Exp Bio Med，2007，232（10）：1275-1288.

[3] Wauquier F，Léotoing L，Philippe C，et al. Pros and cons of fatty acids in bone biology [J]. Prog Lipid Res，2015，58（3）：121-145.

[4] 譚锦辉，黄志祥，李天旺.多不饱和脂肪酸在骨质疏松症中的研究进展[J].临床医学工程，2012，19（7）：1218-1220.

[5] Candelario J，Tavakoli H，Chachisvilis M. PTH1 receptor is involved in mediating cellular response to long-chain polyunsaturated fatty acids [J]. PLoS One，2012，7（12）：5806-5819.

[6] 许兵，方剑利，刘慧，等.补肾活血方对去势大鼠骨质疏松的影响[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2011，4（3）：177-182.

[7] 朱希，尹华，李渊贞.补肾活血颗粒的干燥及成型工艺研究[J].中华中医药学刊，2013，31（3）：585-588.

[8] 沈晨啸，章建华，尹华.补肾活血颗粒对维甲酸所致大鼠骨质疏松模型的药效学研究[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（20）：154-158.

[9] 谷满仓，钱亚芳.超临界CO2流体萃取-精馏联用技术提取脱酸月见草油的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（13）：21-24.

[10] 王亚婷，何轶，王瑞忠，等.GC法同时测定蜂房药材中5个脂肪酸的含量[J].药物分析杂志，2015，36（3）：420-424.

[11] 曾广胜，盛卫国，叶剑锋，等.油菜花脂肪酸成分气象指纹图谱研究及聚类分析[J].医药导报，2013，32（5）：677-680.

[12] 肖鲁伟，王伟东，童培建，等.补肾复方含药血清对大鼠成骨细胞OPG、ODF表达的影响[J].中医正骨，2006，18（9）：649-651.

[13] 许兵，金红婷，王萧枫，等.补肾活血含药血清对成骨细胞经典Wnt/β-catenin通路的影响研究[J].中国骨伤，2015，28（6）：553-558.

[14] 刘慧，许兵，方剑利，等.补肾活血颗粒对去势大鼠血生化的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（5）：1435-1438.

[15] 韩丽萍，魏敏惠，王相东，等.补肾活血方及其拆方对骨质疏松大鼠骨密度及其组织形态的影响[J].陕西中医学院学报，2013，35（6）：177-182.

[16] 陈为飞，李渊贞，朱希，等.HPLC同时测定补肾活血颗粒中松脂醇二葡萄糖苷、苦杏仁苷、桂皮醛的含量[J].中国现代应用药学杂志，2015，32（4）：463-466.

[17] Harris TB，Song X，Reinders I，et al. Plasma phospholipid fatty acids and fish-oil consumption in relation to osteoporotic fracture risk in older adults：the age，gene/environment suscep？鄄tibility study [J]. Am J Clin Nutr，2015，101（5）：947-955.

[18] Macdonald HM，New SA，Golden MH，et al. Nutritional associations with bone loss during the menopausal transition：evidence of a benefi cial effect of calcium，alcohol，and fruit and vegetable nutrients and of a det-rimental effect of fatty acids [J]. Am J Clin Nutr，2004，79（1）：155-965.

[19] Rahman MM，Fernandes G，Williams P. Conjugated linoleic acid prevents ovariectomy-induced bone loss in mice by modulating both osteoclastogenesis and osteoblastogenesis [J]. Lipids，2014，49（3）：211-224.

[20] Spilmont M，Leotoing L，Davicco MJ，et al. Pomegranate seed oil prevents bone loss in a mice model of osteoporosis，through osteoblastic stimulation，osteoclastic inhibition and decreased inflammatory status [J]. J Nutr Biochem，2013，24（11）：1840-1848.

（收稿日期：2016-11-28 本文編辑：李亚聪）