儿童急性淋巴细胞白血病骨髓细胞形态学检查多中心综合比较及评价

张 雪，李 蓓，陈振萍，吴敏媛，李志刚

(1.儿童血液病与肿瘤分子分型北京市重点实验室、儿科学国家重点学科、教育部儿科重大疾病研究重点实验室、首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心，北京100045;2.首都医科大学附属北京儿童医院科研处，北京100045)

骨髓细胞形态学检查因其方法简单、报告及时、参考价值大，在血液系统疾病诊断中发挥着相当关键的作用。但是在多数情况下，由于骨髓取材过程、染色、检验人员判定能力以及所用术语习惯的不同，使这项诊断技术缺乏统一的标准，特别是在一些恶性血液系统疾病的诊断、治疗中，更需要进一步规范。

急性白血病(acute leukemia，AL)是儿童最常见的恶性肿瘤，其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)约占儿童 AL的70%[1]。目前，ALL多采用 MIC(细胞形态学、免疫学、细胞遗传学)分型法。其中骨髓细胞形态学诊断因不受实验室规模和仪器限制，往往作为ALL诊断的首选项目，同时也是ALL后续治疗评估、调整治疗方案的重要依据之一。但是，骨髓细胞形态学检查作为一项特殊性检验项目，影响因素相对较多，同时对检验人员的素质、能力要求比较严格、苛刻。因此其客观性往往不如免疫学和细胞遗传学检查。

2008年，由首都医科大学附属北京儿童医院、中国医学科学院北京协和医学院血液病医院、香港威尔斯亲王医院、苏州大学附属儿童医院等全国13家医院以及首都医科大学共同组成了中国儿童白血病协作组(Chinese Children's Leukemia Group，CCLG)，研究儿童 ALL 诊断、规范性治疗及预后评估。该项目的重要内容之一就是完善并统一儿童ALL在细胞形态学的诊断及评估标准。

材料和方法

一、研究对象

CCLG的13家成员医院于2008年1月至2010年12月期间共收治1 091例ALL患儿，其中男童653例，女童438例，中位年龄4岁(0.5～16岁)。协作组成员医院对ALL患儿采用统一的入组标准[2]，其中标危组 480 例(44.0%)、中危组395例(36.2%)、高危组 216 例(19.8%)。ALL患儿治疗期间统一使用CCLG-ALL2008治疗方案[2]。所有病例的中位随访时间为18个月(0.4个月 ～36个月)。

二、研究方法

1.建立多中心协作的资料采集、登记、共享的网络信息管理系统。

2.经过CCLG各成员医院协商，通过网络信息管理系统，使用单纯随机抽样方法，分别从标危组、中危组、高危组抽取10%样本，其中，标危组48例、中危组40例、高危组22例，共计110例。登记被抽样ALL患儿资料，包括姓名、性别、年龄、收治医院、入院时间。

3.将被抽样患儿资料反馈给其收治医院，同时依据CCLG-ALL2008治疗方案规定的骨髓检查时间，要求该医院提供该患儿的初诊、治疗第15天、治疗第33天以及治疗第12周的骨髓细胞涂片及相对应的原始报告。

4.由专人接收、登记各医院复检骨髓细胞涂片及原始报告，并将复检骨髓细胞涂片及原始报告统一登记管理。

5.采用电脑随机派位方法，将骨髓细胞涂片平均分配给2名检验人员进行复检，复检内容包括骨髓细胞分类(CCLG各成员医院均计数200个有核细胞)、描述骨髓像特点、提出检验结论。复检人员均专职负责骨髓细胞涂片检查，且均为中级技术职称。

6.由血液专业临床医师和检验技师各一名，对骨髓细胞涂片复检报告和原始报告进行审核、比对、分析，并提供书面意见。

7.将骨髓细胞涂片、复检报告以及反馈意见发还给CCLG各成员医院。

结 果

一、骨髓取材及增生程度判断

在随机抽取的110个样本共440份骨髓细胞涂片中有12份(2.7%)骨髓细胞涂片复检报告与原始报告均判断取材稀释，且均未描述骨髓增生程度，其中治疗第15天骨髓细胞涂片7份(1.6%)、治疗第 33天骨髓细胞涂片 5份(1.1%)。13 份(3.0%)骨髓细胞涂片复检报告判断骨髓取材稀释，未描述骨髓增生程度;而原始报告判断该13份骨髓细胞涂片取材良好，均描述骨髓增生减低，其中治疗第15天骨髓细胞涂片7份(1.6%)，治疗第 33天骨髓细胞涂片 6份(1.4%)。其余 415 份(94.3%)骨髓细胞涂片复检报告与原始报告均判断骨髓取材良好，其骨髓增生程度描述也基本吻合。报告存在分歧的13份骨髓细胞涂片，经过复审，支持复检报告结论。

二、染色情况

复检报告中有7份(1.6%)初诊骨髓细胞涂片描述染色偏浅，5份(1.1%)初诊骨髓细胞涂片描述染色偏深;这12份骨髓细胞涂片原始报告均描述染色良好。其余428份(97.3%)骨髓细胞涂片的复检报告与原始报告均描述染色良好。报告存在分歧的12份骨髓细胞涂片经过复审，支持复检报告结论。

三、骨髓像特点描述

复检报告与原始报告描述骨髓像特点时均不同程度存在使用语言不规范，名词术语使用不统一，中、英文混用以及使用不规范的缩略语或英文缩写等现象。同时，各CCLG成员医院骨髓细胞形态学检验报告格式不统一。

表1 儿童ALL初诊及治疗期间骨髓细胞涂片复检与原始报告符合情况统计 [份(%)]

四、检验结论

除骨髓取材情况存在异议的骨髓细胞涂片以及稀释骨髓细胞涂片复检报告及原始报告均建议复查、未下检验结论外，其余415份(94.3%)骨髓细胞涂片复检报告与原始报告检验结论基本吻合。其中110份初诊骨髓细胞涂片检验结论均为ALL;在96份ALL治疗第15天骨髓细胞涂片中，76份(79.2%)诊断为完全缓解(CR)、13份(13.5%)诊断为部分缓解(PR)、7 份(7.3%)诊断为未缓解(NR);在99份ALL治疗第33天骨髓细胞涂片中，93份(93.9%)诊断为 CR、4份(4.0%)诊断为 PR、2 份(2.0%)诊断为 NR;在110份ALL治疗第12周骨髓细胞涂片中，109份(99.1%)诊断为 CR、1 份(0.9%)诊断为骨髓复发。

表2 儿童ALL骨髓复检与原始报告缓解情况符合统计 [份(%)]

讨 论

世界卫生组织(WHO)新的分型系统强调了形态学在血液系统疾病诊断的重要性。特别是在急性白血病的分型和治疗评估中，骨髓细胞形态学检查更具有重要的参考价值和意义[3]。CCLG各成员医院骨髓细胞涂片的制作和常规染色比较统一，没有特殊或改良方法。但是在日常工作中，由于工作人员在实际操作中存在技术和习惯性差异，可能造成骨髓细胞在取材、制片及染色过程中出现与理论要求不同;同时，由于检验人员的细胞辨别能力以及细胞形态术语应用习惯的差异，影响了骨髓细胞形态学诊断的客观性和一致性，使这项诊断技术缺乏标准化，在跨地区、跨医院进行骨髓细胞涂片会诊中出现检验结论偏差。因此，多中心进行骨髓细胞涂片的室间比对在统一骨髓细胞形态学检验方法，提高实验室骨髓细胞形态学检验水平的同时，通过讨论和协商，建立统一的骨髓细胞形态检验标准及报告格式，为多中心协作发展和血液系统及相关疾病的病例会诊、讨论提供了统一的实验室平台。

骨髓细胞取材是骨髓细胞学检查的基础，但有时骨髓穿刺采集标本时常混血稀释，影响骨髓细胞学检查结果。因此，鉴别稀释骨髓细胞涂片是能否正确诊断血液系统疾病的前提。但是，目前《全国临床检验操作规程》等有关文献都未明确提及骨髓细胞涂片稀释的判断标准。因此，在实际工作中往往凭借检验人员的经验判断，易造成偏差。特别是在儿童ALL治疗第15天和治疗第33天期间，其骨髓增生受到化疗药物抑制，骨髓穿刺时易出现骨髓干抽，造成骨髓稀释现象，而稀释骨髓细胞涂片中白血病细胞比值常少于取材良好的骨髓细胞涂片。因此，正确判断骨髓稀释与骨髓抑制期的骨髓增生减低是评估ALL患儿治疗效果，继续或调整治疗方案的重要保证。本研究中有13份骨髓细胞涂片原始报告判断骨髓增生减低，但复检报告判断骨髓稀释，而这13份标本均为治疗第15天或治疗第33天骨髓。另外，有12份骨髓细胞涂片复检报告与原始报告均判断为骨髓稀释，这12份标本也均为治疗第15天或治疗第33天骨髓。因此，鉴别骨髓细胞涂片是否稀释需要检验人员长期的经验积累和对该疾病以及该疾病治疗期间骨髓特点的准确认识和把握。同时，多部位骨髓穿刺取材也是鉴别骨髓抑制或骨髓稀释的方法，但对患者创伤较大，操作时应慎重。

本研究中除12份稀释骨髓细胞涂片和13份骨髓取材情况有异议的骨髓细胞涂片外，其余415份骨髓细胞涂片增生程度的判断非常吻合。目前，对骨髓增生程度的分级标准[4-5]已经非常明确，一般采用五级分级法[5]。即使对于骨髓细胞形态初学者也可以参照分级标准对骨髓增生程度进行正确判断。但是，对于稀释骨髓细胞涂片不应进行增生程度分级，但应对骨髓稀释程度进行适当说明或描述。

骨髓细胞涂片染色目前多采用Wright染液或Wright-Giemsa混合染液[6]染色，方法均比较成熟。本研究中原始报告对骨髓细胞涂片染色均描述染色良好，但在复检报告中出现ALL患儿初诊骨髓细胞涂片染色偏浅或偏深现象。骨髓细胞涂片染色情况直接影响检验人员对骨髓细胞的辨别。因此，当不能把握染色过程中细胞着色程度时，应在涂片染色过程中使用显微镜低倍镜反复、多次观察涂片中有核细胞染色情况。当有核细胞染色略深于正常颜色时方可冲去染液。同时，骨髓细胞涂片染色时间应结合涂片中有核细胞数量、染液与缓冲液比例、实验室温度等因素灵活掌握，不能一概而论。ALL患儿初诊骨髓细胞涂片中有核细胞相对较多，造成染色时间掌握不准确，使有核细胞着色不好。

CCLG各成员医院由于各实验室骨髓细胞学检查电脑软件操作平台不同，同时各医院对骨髓细胞形态学检验报告要求存在差异，检验人员对骨髓像描述习惯不同，在骨髓细胞涂片检查中往往存在报告内容不统一，描述骨髓像特点时专业术语使用不规范等现象，例如在描述骨髓增生程度时出现“Ⅰ～Ⅴ级”分级和“增生极度活跃、明显活跃、活跃、减低和极度减低”分级两种描述方法;另外，还存在部分细胞形态特点描述不一致，中文命名不统一，中、英文混用以及使用不规范中文缩略语或英文缩写等现象。这些问题说明细胞形态学领域需要达成必要的共识，这将有助于提高骨髓细胞形态学诊断综合水平，同时对于跨地区、跨医院骨髓细胞涂片会诊提供统一、规范的标准。

目前，骨髓细胞形态学的方法学已经相当成熟。但在实际操作中，由于骨髓细胞形态学检验专职人员相对较少，而细胞形态学本身具有专业性、经验性强和有一定传承性的特点。同时，检验人员对骨髓各阶段细胞形态尺度及标准的把握，对疾病发生、发展过程中骨髓特点的掌握均不同程度的影响检验结论，造成骨髓细胞涂片在会诊过程中结论出现差异。因此，要提高骨髓细胞形态学诊断水平就需要完全依靠检验人员扎实的理论基础和长期工作经验的积累，这也是血液实验室管理中的重点、难点[7]。同时，实验室间定期交流比对、实验室内部对疑难细胞涂片讨论学习、检验人员的定期培训和考核[8]以及积极参加骨髓读片会都是提高实验室检验水平、强化检验人员综合素质、统一实验室诊断标准的必要手段和方法。

本研究仅对CCLG成员医院儿童ALL骨髓细胞涂片检查进行比较评价，存在一定局限性，而对于其它疾病的骨髓细胞形态学检查还需要各医院实验室间进行定期比对和长期的经验和人员交流，通过讨论、协商，统一标准，最终达到各成员医院间骨髓细胞形态学检查结果的互认。

致谢:CCLG成员医院(排名不分先后)为中国医学科学院北京协和医学院血液病医院、香港威尔斯亲王医院、北京大学人民医院、首都儿科研究所附属儿童医院、中国人民解放军总医院、中国人民解放军海军总医院、苏州大学附属儿童医院、重庆医科大学附属儿童医院、华中科技大学同济医学院附属协和医院、哈尔滨市儿童医院、四川大学华西医学中心第二附属医院、复旦大学附属儿科医院。

[1]McCredie M，Williams S.Coates M.Cancer mortality in migrants from the British Isles and continental Europe to New South Wales，Australia，1975-1995[J].Int J Cancer，1999，83(2):179-185.

[2]吴敏媛，李志光，李志刚.儿童急性淋巴细胞性白血病治疗策略的思考[J].中华儿科杂志，2010，48(3):161-165.

[3]Zini G，Bain B，Bettelheim P，et al.A European consensus report on blood cell identification:terminology utilized and morphological diagnosis concordance among 28 experts from 17 countries within the European Leukemia Net network WP10，on behalf of the ELN Morphology Faculty[J].Br J Haematol，2010，151(4):359-364.

[4]袁毓贤，李文成.实用血液学细胞学图谱[M].北京:人民卫生出版社，2001:10-11.

[5]徐文荣，王建中.临床血液学与检验[M].第4版.北京:人民卫生出版社，2009:64-66.

[6]Jaffe ES，Harris NL，Stein H，et al.Pathology and genetics of tumours of haematopietic and lynphoid tissues[M].Lyon:IARC Pess，2001:78.

[7]丛玉隆.ISO15189认可现场评审引发的对细胞形态学检验问题的思考[J].中华检验医学杂志，2008，31(7):725-728.

[8]陈丽娟，何海峰，张发展.实验室内部质量控制方法的探讨[J].现代测量与实验室管理，2008，16(4):34-35.