重金属污染土壤微生物多样性研究方法

李焱+李云云

摘 要：該文主要对近年来重金属污染土壤微生物多样性的研究方法进行归纳概括，并对各自的优缺点以及适用情况进行分析，对微生物的研究方法进行了展望。

关键词：重金属污染；土壤微生物；微生物多样性；研究方法

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0036-03

Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil

Li Yan1 et al.

（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）

Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.

Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods

近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。

1 土壤微生物研究方法

1.1 传统的分离纯培养和稀释平板计数 在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。

1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。

1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。

1.4 变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE） 该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DNA片段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。

1.5 高通量测序技术 高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。

1.6 基因芯片技术（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新強有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。

2 不同方法在重金属污染土壤中的应用

刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。

目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。

参考文献

[1]高焕梅，孙燕，和林涛.重金属污染对土壤微生物种群数量及活性的影响[J].江西农业学报，2007，19（8）：83-85.

[2]胡婵娟，刘国华，吴雅琼.土壤微生物生物量及多样性测定方法评述[J].生态环境学报，2011，20（z1）：1161-1167.

[3]李椰.土壤微生物研究方法概述[J].青海畜牧兽医杂志，2016，46（3）：51-53.

[4]蔡燕飞，廖宗文.土壤微生物生态学研究方法进展[J].生态环境学报，2002，11（2）：167-171.

[5]Macura J.Trends and advances in soil microbiology from 1924 to 1974[J].Geoderma，1974，12（4）：311-329.

[6]毛雪飞，吴羽晨，张家洋.重金属污染对土壤微生物及土壤酶活性影响的研究进展[J].江苏农业科学，2015，43（5）：7-12.

[7]Zhiqiang Y U.Microbial Remediation of Heavy Metal（loid）Contaminated Soil：A Review[J].Agricultural Science & Technology，2016，17（1）：85-91.

[8]李晶，刘玉荣，贺纪正，等.土壤微生物对环境胁迫的响应机制[J].环境科学学报，2013，33（4）：959-967.

[9]陈欣瑶，杨惠子，陈楸健，等.重金属胁迫下不同区域土壤的生态功能稳定性与其微生物群落结构的相关性[J].环境化学，2017（2）：356-364.

[10]钟文辉，蔡祖聪.土壤微生物多样性研究方法[J].应用生态学报，2004（05）：899-904.

[11]王强，戴九兰，吴大千，等.微生物生态研究中基于BIOLOG方法的数据分析[J].生态学报，2010（3）：817-823.

[12]胡可，王利宾.BIOLOG微平板技术在土壤微生态研究中的应用[J].土壤通报，2007，38（4）：819-821.

[13]王强，戴九兰，吴大千，等.微生物生态研究中基于BIOLOG方法的数据分析[J].生态学报，2010，30（3）：817-823.

[14]郑华，欧阳志云，方治国，等.BIOLOG在土壤微生物群落功能多样性研究中的应用[J].土壤学报，2004，41（3）：456-461.

[15]吴建军，蒋艳梅，吴愉萍，等.重金属复合污染对水稻土微生物生物量和群落结构的影响[J].土壤学报，2008，45（6）：1102-1109.

[16]于树，汪景宽，李双异.应用PLFA方法分析长期不同施肥处理对玉米地土壤微生物群落结构的影响[J].生态学报，2008，28（9）：4221-4227.

[17]毕明丽，宇万太，姜子绍，等.利用PLFA方法研究不同土地利用方式对潮棕壤微生物群落结构的影响[J].中国农业科学，2010，43（9）：1834-1842.

[18]喻曼，肖华，张棋，等.PLFA法和DGGE法分析堆肥细菌群落变化[J].农业环境科学学报，2011，30（6）：1242-1247.

[19]Widmer F，Flie?bach A，Laczkó E，et al.Assessing soil biological characteristics：a comparison of bulk soil community DNA-，PLFA-，and BiologTM-analyses[J].Soil Biology & Biochemistry，2001，33（7–8）：1029-1036.

[20]Howeler M，Ghiorse W C，Walker L P.A quantitative analysis of DNA extraction and purification from compost[J].Journal of Microbiological Methods，2003，54（1）：37.

[21]Sundh I，Nilsson M，Borga P.Variation in microbial community structure in two boreal peatlands as determined by analysis of phospholipid Fatty Acid profiles.[J].Appl Environ Microbiol，1997，63（63）：1476-1482.

[22]颜慧，蔡祖聪，钟文辉.磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报，2006，43（5）：851-859.

[23]夏围围，贾仲君.高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价[J].微生物学报，2014，54（12）：1489-1499.

[24]宋洋，李柱刚.DGGE技术在土壤微生物群落研究中的应用[J].黑龙江农业科学，2010（7）：5-8.

[25]Green S J，Leigh M B，Neufeld J D.Denaturing Gradient Gel Electrophoresis（DGGE）for Microbial Community Analysis[J].2017.

[26]刘权钢，金东淳，刘敬爱.DGGE技术在土壤微生物多样性分析上的研究进展[J].延边大学农学学报，2012，34（2）：170-176.

[27]Ferris M J，Muyzer G，Ward D M.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial mat community.[J].Applied & Environmental Microbiology，1996，62（2）：340.

[28]Quail M A，Kozarewa I，Smith F，et al.A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.[J].Nature Methods，2008，5（12）：1005.

[29]Meyer M，Stenzel U，Hofreiter M.Parallel tagged sequencing on the 454 platform[J].Nature Protocols，2008，3（2）：267-78.

[30]Gomezalvarez V，Teal T K，Schmidt T M.Systematic artifacts in metagenomes from complex microbial communities.[J].Isme Journal，2009，3（11）：1314.

[31]楼骏，柳勇，李延.高通量测序技术在土壤微生物多样性研究中的研究进展[J].中国农学通报，2014，30（15）：256-260.

[32]钟毅，张旭，梁玉婷，等.基于基因芯片技术的石油污染土壤微生物群落结构[J].清华大学学报（自然科学版），2010（9）：1396-1399.

[33]He Z L，Gentry T J，Schadt C W，et al.Geochip：A comprehensive microarray for investigating biogeochemical，ecological and environmental processes.ISME J，2007，1：67–77

[34]孙寓姣，张惠淳.功能基因芯片在土壤微生态研究中的应用[J].南水北调与水利科技，2013（1）：93-96.

[35]Zhou J，Thompson D K.Challenges in applying microarrays to environmental studies[J].Current Opinion in Biotechnology，2002，13（3）：204-207.

[36]严春光，陈钧辉，王新昌.基因芯片及其应用[J].中国生化药物杂志，2006，27（5）：321-323.

[37]劉云国，周娜，樊霆，等.铜、锌离子抗性菌筛选及重金属作用下富集特性研究[J].湖南大学学报（自科版），2009，36（2）：80-84.

[38]张秀，夏运生，尚艺婕，等.生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响[J].中国环境科学，2017，37（1）：252-262.

[39]孙婷婷，徐磊，周静，等.羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响[J].土壤，2016，48（5）：946-953.

[40]郑涵，田昕竹，王学东，等.锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响[J].中国环境科学，2017，37（4）：1458-1465.

[41]江玉梅，张晨，黄小兰，等.重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响[J].中国环境科学，2016，36（11）：3475-3486.

（责编：张宏民）