人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

卢慧惠， 彭 林， 段作营， 蔡燕飞， 金 坚， 李华钟*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

卢慧惠1， 彭 林1， 段作营1， 蔡燕飞2， 金 坚2， 李华钟*1

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用，常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病，但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的pMH3质粒，并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese hamster ovary cell，CHO细胞）中，利用pMH3质粒所携带的neo基因进行筛选，经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞，融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现，融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中，而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现，筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性，表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。

人白介素-2；人血清白蛋白；融合蛋白；中国仓鼠卵巢细胞

白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）又称T细胞生长因子，是Morgan[1]等人用丝裂原、刀豆蛋白刺激T淋巴细胞时产生的一种因子。IL-2在机体免疫应答中具有重要的作用，在临床上用于肿瘤、肝炎、免疫缺陷性疾病的治疗。但IL-2相对分子质量小，体内半衰期仅为6.9 min[2]，多次高剂量注射可能造成不良副作用[3]，给患者带来很大的困扰，限制了其在临床上的应用[4]。人们通过白蛋白融合技术增加药物相对分子质量的方法来延长药物半衰期[5]。关波等人通过HSA融合技术在毕赤酵母中成功表达了具有生物活性的融合蛋白IL-2-HSA，该融合蛋白在体内半衰期的延长至13.24 h。但在毕赤酵母中表达融合蛋白时，产物存在不均一、过度糖基化和降解等问题，在生产应用中受到很大限制[6]。目前中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese hamster ovary cell，CHO细胞）已经成为表达重组蛋白药物最为理想的宿主之一[7]，CHO细胞表达的糖基化药物最接近天然蛋白质，而且很少分泌自身内源蛋白，产物胞外分泌，利于纯化。本研究中利用CHO表达系统的优势，在CHO表达系统中对IL-2和HSA融合蛋白进行表达，将IL-2连接到HSA的C端，期望获得高效表达融合蛋白HSA-IL-2的CHO细胞系，为HSA融合蛋白药物提供新的表达思路。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pPIC9K/IL-2-HSA，由作者所在实验室保存；CTLL-2细胞和IL-2标准品，江苏金斯利药业有限公司馈赠；CHO-S细胞和 pMH3质粒，AmProtein公司馈赠；大肠杆菌DH5α，T4连接酶，限制性内切酶Eco RI，Not I、DNA聚合酶等，购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物回收试剂盒等，购自上海生工生物公司；DMEM-F12培养基和胎牛血清 （FBS），购自Gibco公司；G418，MTT，购自Sigma公司；兔抗人IL-2抗体，鼠抗人HSA（HRP）抗体，鼠抗人HSA抗体，购自abcam公司；山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗，购自碧云天公司；ELISA试剂盒，购自联科生物公司；其余均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 PCR扩增引物

表1中H1和I2的波浪线分别为Eco RⅠ和NotⅠ的酶切位点。H1中Eco RⅠ后CACC为Kozac序列，下划线部分为Igk信号肽序列，引物H2和I1有20个碱基完全互补，以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HSA-IL-2融合蛋白PCR引物Table 1 Primers of HSA-IL-2 fusion protein

1.3 表达载体pMH3/HSA-IL-2的构建

分别以表1中H1、H2和I1、I2为引物，质粒pPIC9K/IL-2-HSA为模板，扩增出HSA和IL-2基因片段。纯化两PCR产物并按照摩尔比1∶1混合进行拼接，再以拼接产物为模板，H1和I2为引物扩增HSA-IL-2融合基因全长HSA-IL-2。用PCR产物回收试剂盒回收目的片段，经EcoRⅠ与NotⅠ酶切、回收，并连接至pMH3载体的EcoRⅠ与NotⅠ酶切位点之间，转化DH5α感受态细胞，涂布于LB固体培养平皿上 （含100μg/mL的Amp），37℃培养，挑取单菌落进行PCR及双酶切电泳图谱鉴定，并测序验证。

1.4 CHO-S细胞的转染

CHO-S细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养，当细胞长至汇合度80%左右时，用胰酶消化，离心收集细胞，PBS重悬并调整细胞浓度为1.5×107cells/mL。取200μL细胞悬液，10μg质粒进行电转染。电转条件为：500 V，500μs电击4次，每两次电击间隔冰浴1min。电击后将电极杯中的细胞悬液均分至两个10 cm培养皿（DMEM/F12，含体积分数10%胎牛血清）中培养24 h后，加入终质量浓度为1.5mg/LG418进行筛选，期间观察细胞状态，待细胞出现大量死亡时（一般2～3 d）更换到含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养，待细胞克隆长出。

1.5 稳定表达HSA-IL-2细胞株的筛选

待细胞克隆长至合适大小后将所有单克隆挑至96孔板中。在含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养7～8 d后，PBS清洗细胞，每孔加入100μL无血清培养基，48 h后，取上清液用鼠抗人HSA（HRP）抗体进行Dot-blot检测，进行快速筛选。得到的HSA-IL-2高表达克隆转入24孔板中，培养2～3 d后用PBS清洗，每孔加入200μL无血清培养基，48 h后，取上清液进行Dotblot检测，并用HSA标准品作为阳性对照，进一步筛选高表达细胞株。同时ELISA法检测细胞株的表达水平，并挑选表达量最高的细胞株，命为CHO-HI。

Dot-blot检测的具体步骤如下：培养上清液按照顺序点到NC膜上，5 g/dL脱脂奶粉37℃封闭2 h，鼠抗人HSA （HRP）抗体37℃孵育1 h，TBST（TBS含体积分数0.5%Twen-20）漂洗3次，ECL显色成像。

1.6 稳定表达HSA-IL-2细胞株的鉴定

1.6.1 RT-PCR法 用Trizol法分别提取细胞株CHO-HI和CHO-S细胞的总RNA，分别取1μL RNA为模板进行逆转录合成cDNA。再以cDNA为模板，扩增目的基因片段。PCR扩增产物经1 g/dL琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1.6.2 Western blot检测 取细胞株CHO-HI，48 h表达上清液后进行SDS-PAGE分离，转至NC膜上，5 g/dL脱脂奶粉37℃封闭2 h，兔抗人IL-2或鼠抗人HSA抗体37℃孵育2 h，TBST（TBS含体积分数0.5%Twen-20）漂洗3次，山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗37℃孵育1 h，TBST（TBS含体积分数0.5%Twen-20）漂洗3次，ECL显色成像。

1.7 重组HSA-IL-2生物活性的测定

参照中国药典中的CTLL-2/MTT法[8]，测定CHOHI细胞培养液中的重组HSA-IL-2的生物活性。样品IL-2效价按下式（1）计算待测样品生物学活性

式中，Pr为标准品生物学活性，IU/mL；Ds为待测样品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为待测样品相当于标准品半效的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 表达载体pMH 3/HSA-IL-2的构建

在平板上随机挑选5个克隆，经菌落PCR鉴定，其中2、3、4、5号克隆在2 200 bp处有阳性条带（图1）。

图1 pMH3-HSA-IL-2菌液PCR鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasm id pMH 3-HSA-IL-2 by PCR

提取质粒进行双酶切鉴定，结果在2 200 bp处均出现特异性条带（图2）。测序结果与设计的基因序列比对结果一致，证实重组质粒构建成功。

图2 pMH3-HSA-IL-2质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasm id pMH 3-HSA-IL-2 by enzyme digestion

2.2 细胞株的筛选

将挑取的232株克隆在96孔板中分别进行培养，表达并取上清液进行Dot-blot检测，图3显示了部分结果。将其中表达量较高的48株细胞，分别转到24孔板中进一步筛选。选取其中表达量较高7株用ELISA检测其表达量，结果如表2所示。其中1D3、2B4和2C1这3株的表达量均高于1mg/L，将其置于液氮中进行超低温冷冻保藏，并将表达量最高的2B4命名为CHO-HI。

图3 96孔板克隆筛选结果Fig.3 Screening results in the 96-well plate by Dot-blot

表2 不同HSA-IL-2克隆表达量Elisa检测结果Table 2 Expression level of HSA-IL-2 in different clone detected by Elisa

2.3 细胞株的鉴定

RT-PCR结果（图4）表明，筛选得到的CHO-HI细胞中有HSA-IL-2融合蛋白mRNA表达，而在未转染质粒的CHO-S对照组中并未见mRNA表达。证实HSA-IL-2基因已成功整合至CHO-S细胞基因组中。Western blot检测结果（图5）显示：筛选得到的细胞株CHO-HI培养上清液无论采用HSA抗体，还是采用IL-2抗体，均在82×103左右出现单一的阳性条带，与目标融合蛋白理论相对分子质量相符。这表明目标蛋白质具有HSA和IL-2的双重免疫原性，筛选得到的细胞株CHO-HI能够成功表达HSA-IL-2融合蛋白。

图4 RT-PCR鉴定CHO-HI阳性细胞株Fig.4 Identification of CHO-HI positive transformants by RT-PCR

图5 HSA-IL-2融合蛋白W estern blot鉴定Fig.5 Characterization of the recombinant HSA-IL-2 by W estern blot

2.4 融合蛋白HSA-IL-2活性测定

采用IL-2依赖型细胞株CTLL-2，以标准品IL-2（925 IU/mL）为阳性对照，未转染质粒的CHO-S培养上清液（预稀释2.7倍）为阴性对照，对CHO-HI表达上清液（预稀释2.7倍）的生物学活性进行了测定见图6。结果显示，上清液中的融合蛋白HSA-IL-2可以有效刺激CTLL-2细胞的增殖，其生物学活性约为4.5×104IU/mL。

3 结语

研究中将HSA与IL-2基因融合并克隆至pMH3质粒，成功构建了融合蛋白真核表达质粒pMH3/HSA-IL-2，并成功在CHO细胞中进行了表达。经过筛选得到一株阳性克隆CHO-HI，ELISA试剂盒测定融合蛋白表达量为2.26 mg/L。经mRNA和蛋白质水平检测，表明HSA-IL-2基因已经整合入CHO细胞基因组，表达产物相对分子质量为8 200与HSA-IL-2融合蛋白理论相对分子质量相符，而且具有HSA和IL-2双重免疫原性，得到了稳定表达HSA-IL-2融合蛋白的细胞株CHO-HI，而且Western blot检测没有观察到降解现象。所表达的融合蛋白HSA-IL-2可以有效促进CTLL-2细胞的增殖，表现出较高的生物活性。

图6 HSA-IL-2生物活性测定Fig.6 Bioactivity assay of HSA-IL-2

作者所在研究室已经在毕赤酵母中成功表达了多种白蛋白融合药物，以延长小分子蛋白质药物的半衰期。实验发现，各种白蛋白融合药物的分泌表达量都有一定的差异。即使是同一种多肽类药物，其表达量和活性也会因其与HSA的连接方式（即接入HSA的C端或N端）、培养条件等因素的不同而有较大差异。可能是因为不同外源蛋白质分子构象复杂程度有差异，而且毕赤酵母糖基化水平、对蛋白质的折叠修饰功能与哺乳动物细胞有所不同，分泌表达具有天然构象的活性分子需要在细胞水平进行更多的改造[9]。CHO表达系统与其他表达系统相比更适于重组蛋白表达[10]：具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白质分子；适应悬浮培养；重组基因高效扩增表达；产物胞外分泌。目前已筛选出可高效表达具有生物活性的HSA-IL-2融合蛋白的CHO-HI细胞株，经过悬浮驯化后，可以达到高密度培养，提高融合蛋白表达量，实现融合蛋白的高效表达，为以后融合蛋白的研究提供新的思路。

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Expression of Human Serum Album in-Interleukin-2 Fusion Protein in Chinese Ham ster Ovary Cells

LU Huihui1， PENG Lin1， DUAN Zuoying1， CAIYanfei2， JIN Jian2， LIHuazhong*1
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Interleukin-2（IL-2）plays an important role in immune response and isw ildly used as therapeutic protein to treat diseases，such as cancer，hepatitis and immunodeficiency.In this study，the pMH3 plasm id containing fusion protein of human serum album in and IL-2 was constructed and then transfected to Chinese hamster ovary （CHO）cells by electroporation.CHO cells stably expressing the targetproteinwere selected by neo gene in pMH3 plasm id and determ ined by Dot-blot during 96-plate culture.The titer of HSA-IL-2 was 2.26 mg/L in the 24-plate culture.Reverse transcription PCR and western blot showed that the gene encoding HSA-IL-2 was integrated to genome of recombinant CHO cells and the secreted fusion protein was detected by antibody to beHSA and IL-2.The biological activity of fusion protein was analyzed by IL-2 dependent CTLL-2 cells，and the resultshowed that the recombinantprotein possessed a high activity.In conclusion，the recombinantCHO cellsproducing biological fusion protein of HSA-IL-2were successfulestablished.

human interleukin-2，human serum album in，fusion protein，Chinese hamsterovary cells

Q 786

A

1673—1689（2017）05—0456—05

2015-03-12

国家863计划项目（2014AA021003）；中科院先导计划项目（XDA01040202）；江苏省优势学科建设工程资助项目。

*通信作者：李华钟（1958—），男，山东龙口人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事微生物制药研究。E-mail：hzhli@jiangnan.edu.cn

卢慧惠，彭林，段作营，等.人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达[J].食品与生物技术学报，2017，36（05）：456-460.