丹参素冰片酯影响大鼠脑组织P-糖蛋白表达研究

张 郑，杨 黎，朱凯莉，周 安，惠爱玲，张文成，吴泽宇

(1. 合肥工业大学食品科学与工程学院天然药物研究所，安徽 合肥 230009；2.安徽中医药大学药学院，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230038)

丹参素冰片酯影响大鼠脑组织P-糖蛋白表达研究

张 郑1，杨 黎1，朱凯莉1，周 安2，惠爱玲1，张文成1，吴泽宇1

(1. 合肥工业大学食品科学与工程学院天然药物研究所，安徽 合肥 230009；2.安徽中医药大学药学院，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230038)

目的 考察丹参素冰片酯(DBE)及丹参素钠-冰片(SDSS-B)等摩尔联合用药的脑部靶向作用与其对P-糖蛋白表达的影响。方法 采用LC-MS分析大鼠尾静脉注射DBE、SDSS-B及SDSS后脑部丹参素分布量；蛋白免疫印迹法分析3种给药方式对大鼠脑组织P-糖蛋白(P-gp)表达量的影响。结果 以大鼠脑部丹参素分布定性评价其脑靶向大小为：DBE(SDSS-B)>SDSS；蛋白免疫印迹结果分析显示：DBE和SDSS-B给药均可有效降低大鼠海马组织P-gp表达水平(P<0.01，与Control组对比；P<0.01，与SDSS组对比)，其表达量在给药45 min时分别降至(47.58±2.28)%及(46.54±1.41)%；SDSS给药对P-gp表达量几乎无明显抑制作用(P>0.05在5、15、45、60 min，与Control组对比)。结论 DBE和SDSS-B均表现出脑部靶向作用，其靶向作用与其降低脑组织P-gp表达量有关。

丹参素；冰片；丹参素冰片酯；联合用药；脑靶向；P-糖蛋白；蛋白免疫印迹法

丹参素(Danshensu, DSS)，化学名称为D-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸，是中药丹参的主要活性成分之一，它能缓解脑缺血/再灌注大鼠的脑组织病理性损伤、减弱其神经细胞凋亡[1]，其亦能穿透血脑屏障(blood brain barrier, BBB)到达脑部[2]，上述研究表明丹参素有望用于脑血管相关疾病的治疗。然而，丹参素(Fig 1)结构中含有不稳定的邻二酚羟基，易发生氧化，性质不稳定；而且其羧基能够和人体内葡萄糖醛酸等结合随尿液排出体外，故在体内半衰期也非常短，这也限制了它的临床应用[3]。另外，尽管静脉给予丹参素(15 mg·kg-1)15 min，其脑部浓度达4.6 μg·g-1；但30 min脑部浓度已降低60%[2]，这除了脑细胞对丹参素清除效应外，BBB上存在的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)外排泵作用对丹参素转运至脑亦具有抑制作用[3-4]。故此，本实验室以具有P-gp抑制作用的小分子或药效团为载体，设计合成了一系列丹参素脑靶向衍生物，如丹参素-吡嗪酯(DT1、DT2、DT3)[5]、丹参素冰片酯(Danshensu borneol ester, DBE)及其乙酰化产物(Ac-DBE)(Fig 1)等。

Fig 1 Chemical structure of Danshensu and its brain-targeting derivatives

A: Danshensu; B: DT1; C: DT2; D: DT3; E: DBE; F: Ac-DBE

DBE是将冰片(borneol)分子的羟基引入丹参素羧基发生1 ∶1(摩尔比)酯化的产物。已有研究表明，冰片能促进药物透过BBB，提高其他药物生物利用度[6]；且能促进川芎嗪[7]、丹参素[8]、栀子苷[9]等通过BBB，增加其脑组织浓度，如丹参-冰片配伍(折算为丹参素 ∶冰片=1 ∶5，摩尔比)能使家兔脑组织的丹参素浓度由0.174 μg·g-1提高至0.637 μg·g-1[8]。此外，冰片能抑制P-gp对长春新碱、木通皂苷D的外排作用，提高其细胞内浓度[10-11]。DBE分子由冰片-丹参素缀合而成，冰片的引入是否会促使DBE更易跨越BBB，并对P-gp产生抑制作用，这种作用与丹参素钠(sodium Danshensu, SDSS)-冰片等摩尔联合给药(SDSS-B)相比是否更有优势？因此，对DBE及SDSS-B给药后的脑部分布及其对脑组织P-gp调控作用研究尤为重要。

本实验室前期研究表明，BBB通透性增加、P-gp ATP酶活性升高、P-gp表达水平及外排功能减弱均有助于银杏内酯前药PGB的脑靶向效率提高[12-13]。为此，本文采用LC-MS初步分析大鼠尾静脉注射DBE、SDSS-B及SDSS后的脑部分布规律，以此推测DBE及SDSS-B的脑部靶向作用。在此基础上，结合蛋白免疫印迹法(Western blot)深入探究其对大鼠脑组织P-gp表达量的影响，为丹参素等CNS药物的脑靶向药物设计提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 丹参素冰片酯(DBE)为实验室自制，其结构经1H NMR、13C NMR、MS 确证，HPLC纯度>98%；丹参素钠(SDSS)为南京斯道夫生物科技有限公司提供，HPLC纯度>98%；天然冰片购自江西省吉安市林科天然冰片厂，批号：057001；Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb(C219)购自美国Calbiochem；β-actin(C4): sc-47778 购自美国Santa Cruz Biotechnology, Inc；山羊抗小鼠IgG HRP购自合肥Biosharp公司；PageRuler Prestained Protein Ladder购自Thermo Scientific；丙烯酰胺/双丙烯酰胺(1 ∶29)购自上海生工生物工程有限公司；Aprotini(抑肽酶)、Leupetin(亮抑酶酞)、NP-40、脱氧胆酸钠、PMSF、EDTA、Tris购自Sigma公司；其他试剂购自国药集团，均为分析纯。

1.1.2 仪器 电子分析天平、标准PB-10酸度计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-1600紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂；Sigma 3K15离心机，德国Sigma实验室离心机股份有限公司；Bio-Rad Powerpac Basic电泳仪、Bio-Rad Mini Protein 3 Cell 电泳槽，美国Bio-Rad公司；DYCZ-40D转膜槽，北京市六一仪器厂；FCE化学发光成像系统，美国Protein Simple公司。

1.1.3 实验动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂♀兼用，体质量(225±25) g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证SCXK(皖)2005-001。实验前适应性饲养1周，动物自由进食、饮水，标准颗粒饲料，室温(20±2)℃。实验前动物禁食12 h，期间自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 DBE及SDSS-B联合给药的脑部靶向作用分析

1.2.1.1 动物分组及给药 SD大鼠随机分为DBE给药组(45.5 mg·kg-1)、SDSS-B联合给药组(30 mg·kg-1～21 mg·kg-1，SDSS与B等摩尔剂量)、SDSS给药组(30 mg·kg-1)和控制组(仅给予溶媒，聚乙二醇400 ∶乙醇=8 ∶2)，尾静脉注射给药，于给药后5、15、30、45、60 min，经大鼠眼底静脉丛采血，取血后立即取出脑组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称重后加入4倍量生理盐水(kg·L-1)制成脑匀浆，于-20℃保存，待测。

1.2.1.2 生物样品处理 精密吸取脑匀浆1.0 mL，加入对羟基苯甲酸溶液10 μL(1 mg·L-1，内标)，混匀后加入体积分数为0.1的高氯酸溶液100 μL沉淀蛋白，涡旋振荡1 min后加入乙酸乙酯2 mL，涡旋振荡3 min，4℃离心(12 000 r·min-1，10 min)，取上层有机相，40℃水浴氮气流下吹干，残渣用400 μL流动相复溶，离心10 min，取上清液进行LC-MS分析。

1.2.1.3 测定条件 色谱条件：色谱柱Thermo Syncronis-C18(2.1 mm×100 mm，5 μm); 流动相A是体积分数为0.001的甲酸水溶液，B为乙腈，流速为0.3 mL·min-1，梯度洗脱(0～3 min, 70% B-90% B; 3～4 min, 90% B-90% B; 4～5 min, 90% B-70% B)，进样体积5 μL。

质谱条件：离子源：ESI源；扫描方式：负离子多反应检测(MRM)方式扫描；毛细管电压4.2 kV,离子源温度为280℃，雾化器流量8 L·min-1,碰撞气流量：3.5 L·min-1，选择离子对DSS 197.20/179.05；内标137.30/119.20。

1.2.2 DBE及SDSS-B联合给药对大鼠脑部P-gp表达的影响

1.2.2.1 分组及给药 分组与给药同“1.2.1.1”。分别于5、15、30、45、60 min，断头处死给药组及溶媒控制组，立即取出脑组织，剥取海马、脑皮质，剩余脑组织-80℃保存待用。

1.2.2.2 组织总蛋白提取及Bradford法定量 从-80℃冰箱取出海马、皮质及剩余脑组织，加入配制好的组织裂解液，在冰上充分搅碎并裂解1 h，4℃离心(14 000 r·min-1)10 min，吸取上清液用考马斯亮蓝染色，595 nm测吸光度并计算样品蛋白含量。按照20 μL含50 μg蛋白标准制备Western blot所需蛋白样品。每份总蛋白与2×SDS-sample buffer按1 ∶1体积混匀后，沸水中煮10 min，室温冷却待用。

1.2.2.3 Western blot步骤 分离胶与浓缩胶制备好后，所有蛋白样品调至等浓度后上样，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将滤纸、凝胶及PVDF膜夹好放入转移槽中，恒流350 mA，转膜2 h。转膜结束后，TBST缓冲液清洗膜，5%脱脂牛奶室温条件下封闭1 h。封闭结束后TBST洗3次，将PVDF膜剪成分别含有P-gp和β-actin的两部分，分别使用P-gp抗体和β-actin抗体，4℃孵育过夜。TBST洗3次后，加入二抗，室温孵育1 h。TBST洗3次后，显影成像。Image J软件分析目标蛋白质条带的灰度值。

2 结果

2.1 DBE及SDSS-B联合给药的脑部靶向作用分析 大鼠尾静脉注射DBE，给药15 min后，在脑匀浆中即检测到DBE及DBE降解的DSS。若以15 min或30 min SDSS组中分析物(DSS)与内标(HBA)强度比值定为1，则DBE组在15、30 min的相对量分别达到(2.54±0.77)及(2.41±0.63)；SDSS-B组则为(2.80±0.61)及(1.93±0.17)，如Fig 2、3 所示。与直接注射SDSS组相比，DBE及SDSS-B 组在15 min或30 min的脑匀浆DSS分布均有较大幅度提高(P<0.01)。在给药15 min时，DBE组DSS脑部分布相比SDSS-B略低，这可能与DBE需缓慢释放DSS有关；随着给药时间延长至30 min，DBE组DSS脑部量较SDSS-B组提高24.9%。以上分析表明，将丹参素DSS改造成脂溶性DBE后，其更易透过BBB，且能在脑部缓慢分解得到DSS，并有可能呈现出长效缓释特性，这对脑血管疾病的长期用药是非常有利的。

2.2 DBE及SDSS-B联合给药对大鼠脑组织P-gp表达的影响

2.2.1 大鼠脑组织不同区域P-gp表达 以β-actin为内参，采用Western blot检测了溶媒控制组(Control组)大鼠脑组织不同区域P-gp表达水平(Fig 4)，海马、脑皮质及剩余脑组织的P-gp相对表达量分别为1.244、1.068及0.930。由此可以看出，大鼠海马组织更容易检测到P-gp，以下给予DBE、SDSS-B及SDSS后大鼠脑组织P-gp表达水平研究均优选海马组织进行。

2.2.2 大鼠给予DBE及SDSS-B后海马组织P-gp表达 大鼠给予DBE、SDSS-B、SDSS及溶媒后，其海马组织的P-gp表达如Fig 5所示，DBE、SDSS-B给药均能降低大鼠海马组织P-gp表达量。以溶媒控制组P-gp相对表达量为100%，其他3种给药方式下P-gp表达量的归一化结果显示，除给药5 min外，DBE及SDSS-B在其他给药间隔均可明显降低P-gp表达(P<0.01)；而且DBE及SDSS-B组的P-gp表达均在给药45 min时处于最低水平，分别达到(47.58±2.28)%和(46.54±1.41)%。然而，对于SDSS组而言，它对P-gp表达仅在给药30 min可降至(93.23±2.73)% (P= 0.013)，其余给药间隔并没表现出明显抑制作用(P>0.05)。此外，我们也注意到DBE与SDSS-B在某些给药时段的P-gp表达有明显差别，但两者并无规律可循。如：给药15 min时，SDSS-B给药对P-gp抑制作用较DBE明显[P=0.000, (70.31±2.14)%vs(88.81±1.12)%]；当给药延长至30 min或45 min,两者P-gp表达量无明显差异(P>0.05)。然而，当给药增至60 min时，DBE给药对P-gp表达抑制作用更明显[P=0.000, (85.04±1.42)%vs(95.29±0.98)%]。

Fig 2 MRM chromatograms of DSS and hydroxybenzoic acid in rat brain homogenate after administration of 15 min

A: DBE group; B: SDSS-B group; C: SDSS group

Fig 3 MRM chromatograms of DSS and hydroxybenzoic acid in rat brain homogenate after administration of 30 min

A: DBE group; B: SDSS-B group; C: SDSS group

Fig 4 P-gp Western blot image in different regions of rat brain

由以上给药初期(15 min)DBE对P-gp表达量的抑制及降解DSS脑部分布均不如SDSS-B明显、而给药后期(30、45、60 min)DBE对P-gp表达量影响与SDSS-B相当或远低于SDSS-B的变化趋势。可以推测，DBE中真正发挥P-gp抑制作用的可能是降解得到的冰片，而非DBE本身。更进一步的解释还需结合给药后各时间段DSS及冰片含量的变化趋势来说明。

Fig 5 Expression of P-gp in rat hippocampus treated with DBE, SDSS-B and SDSS

**P<0.01vsSDSS;##P<0.01vsSDSS-B

3 讨论

DBE是冰片与丹参素缀合而成的化合物，其可抑制β-淀粉样蛋白(amyloid β, Aβ)聚集并具有神经保护作用[14]，对三氯化铁致大鼠中动脉缺血具有保护作用[15]，是一种潜在的治疗脑部疾病的药物。本研究证实了DBE和SDSS-B相对于SDSS给药均具有一定的脑部靶向作用。

药物有无脑靶向性取决于药物BBB通透性强弱，以及入脑药物被外排出脑的难易程度。药物脂溶性增大，其BBB通透性则强。将水溶性DSS改造为酯型DBE后其脂溶性增加，DBE更易跨越BBB到达脑部，致使脑内可供降解为DSS的DBE量上升，这一推测在尾静脉注射DBE 15 min或30 min后,其脑内DSS分布量分别比直接注射SDSS中提高141%～154%得到证实。另一方面，BBB上存在具有外排作用的P-gp,可将入脑药物外排出脑。因此，抑制P-gp表达、减弱P-gp外排泵效能有助于药物实现脑靶向性。本实验中，我们采用Western blot研究DBE、SDSS-B及SDSS对大鼠脑组织P-gp表达量的影响，以此分析上述药物对P-gp的外排抑制作用。Western blot结果提示，DBE及SDSS-B二者均能抑制P-gp表达，这种抑制作用均强于SDSS；而SDSS对P-gp表达并无明显抑制。由此可推测冰片对大鼠海马P-gp表达应具有抑制作用。

综上所述，DBE及SDSS-B给药均可有效降低脑组织中P-gp表达，这或许减弱了P-gp对DBE及分解DSS的外排转运，最终促使DBE及DSS在脑部蓄积，故LC-MS分析DBE给药呈现出一定脑部靶向和缓释作用。如从该层面分析，这种DBE前药方式可能要优于SDSS-B等摩尔联合给药。以上研究结果提示，在DSS结构上引入P-gp抑制小分子可在一定程度上抑制脑组织P-gp表达水平，并促使DSS实现脑靶向作用，这也为其他药物的脑靶向衍生物设计提供了一种设计思路和依据。不过DBE对脑组织P-gp外排功能的影响还需进一步动物实验来验证。

(致谢：本实验均在合肥工业大学天然药物研究所及安徽省中药研究与开发重点实验室完成。感谢本学院神经药理学与毒理学实验室何慧明硕士给予的技术支持。)

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Effect of Danshensu borneol ester on P-glycoprotein expression level in rat brain

ZHANG Zheng1, YANG Li1, ZHU Kai-li1, ZHOU An2, HUI Ai-ling1, ZHANG Wen-cheng1, WU Ze-yu1
(1.InstituteofNaturalMedicine,SchoolofFoodScienceandEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China;2.AnhuiProvinceKeyLabofResearchandDevelopmentofChineseMedicine,CollegeofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the relationship between the brain targeting effect and P-glycoprotein (P-gp) expression level of Danshensu borneol ester(DBE) and the combination use of sodium Danshensu and borneol(SDSS-B).Methods The liquid chromatography mass spectrometry(LC-MS) method was applied to investigate the accumulation of Danshensu(DSS) in rat brain tissues after intravenous injection of DBE, SDSS-B and SDSS. Also their effect on regulating the expression level of P-gp in rat hippocampus was investigated using Western blot.Results The brain targeting effect of DBE, SDSS-B was qualitatively analyzed through the brain distribution of DSS, and the result was DBE(SDSS-B)>SDSS(P<0.01). Meanwhile, the brain distribution of DBE group was slightly lower than SDSS-B group at 15 min, while at 30 min DBE was higher than that of SDSS-B. DBE demonstrated a better slow release property compared to SDSS-B. Western blot analysis indicated that DBE, SDSS-B were more effective in inhibiting the expression of P-gp than SDSS in rat hippocampus(P<0.01vscontrol or SDSS group), and the lowest P-gp expression was obtained with(47.58±2.28)% and (46.54±1.41)% at 45 min after administration of DBE or SDSS-B. Once the administration time was extended to 60 min, the inhibitory effect on P-gp expression of DBE was stronger than SDSS-B[(85.04±1.42)%vs(95.29±0.98)%].However, no significant inhibition of P-gp expression in rat hippocampus was found throughout the treatment of SDSS(P>0.05 at 5, 15, 45, 60 min,vscontrol group).Conclusion An attenuated expression level of P-gp can be realized by DBE and SDSS-B, which is advantageous to their brain targeting.

Danshensu; borneol; Danshensu borneol ester; drug combination; brain targeting; P-glycoprotein; Western blot

2017-05-03，

2017-06-06

国家自然科学基金资助项目(No 21302037)；安徽省科技重大专项项目(No 16030701072)

张 郑(1992-)，男，硕士，研究方向：天然药物开发，E-mail：591292290@qq.com； 惠爱玲(1980-)，女，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向：天然产物开发、脑靶向分子设计，通讯作者，E-mail：haling@hfut.edu.cn

时间：2017-7-7 11:04 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.030.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.015

A

1001-1978(2017)08-1114-06

R-332；R282.71；R284.1；R322.81；R341.32；R977.6