磷酸肌酸对小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及机制研究

韩文峰 魏素菊 郑亚珍

·论著·

磷酸肌酸对小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及机制研究

韩文峰 魏素菊 郑亚珍

目的 探讨磷酸肌酸(creatine phosphate,Cp)对小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及其相关机制。方法 建立昆明小鼠S180肉瘤模型，60只小鼠随机分为4组：0.9%氯化钠溶液对照组(对照组)、Cp低剂量组(200 mg/kg)、Cp中剂量组(400 mg/kg)、Cp高剂量组(800 mg/kg)，观察4组小鼠移植瘤重量；流式细胞术测定基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-2)蛋白的表达；免疫组化检测肿瘤组织微血管密度(microvasvular density，MVD)；RT-PCR检测移植瘤组织中血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth,bFGF)mRNA的表达水平。结果 对照组、Cp低剂量组和中剂量组移植瘤重量、VEGF、bFGFmRNA、MMP-2、TIMP-2水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；Cp高剂量组与对照组、Cp低、中剂量组比较，小鼠移植性肉瘤质量明显减小，MVD数显著减少，VEGF、bFGFmRNA和MMP-2蛋白表达明显减少，TIMP-2蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 Cp低、中剂量对肿瘤血管生成无明显影响；Cp高剂量对肿瘤血管生成具有明显的抑制作用，其机制可能与通过下调MMP-2、VEGF和bFGF、上调TIMP-2的表达水平有关。

磷酸肌酸；S180肉瘤；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；微血管密度

磷酸肌酸(creatine phosphate,Cp)是细胞内的一种高能磷酸化合物，用于三磷酸腺苷的再合成，在心肌细胞缺血缺氧时为其提供能量,保护心肌细胞膜免受氧自由基等有害物质的侵袭[1,2]。Cp还可以透过细胞膜抑制膜通透，改变孔道的开放，保护线粒体，减少细胞凋亡。此外，Cp还可以提高左心室射血分数，改善心功能，增加冠状动脉流量，改善冠状动脉循环。目前，Cp不但应用于体外循环手术中，还应用于治疗心力衰竭、心肌梗死、心律失常、冠状动脉粥样硬化性心脏病，因此保持心肌细胞Cp及三磷酸腺苷等高能磷酸化合物水平可以减轻各种原因对心肌细胞的损害[3,4]。化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但化疗药物的心脏毒性极大限制了其临床应用，理论上可以使用Cp、三磷酸腺苷等高能磷酸化合物预防化疗药物的心脏毒性。但Cp对肿瘤生长具有促进或抑制作用还未见相关基础实验报道。本实验通过Cp对小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及可能机制进行初步探讨，如果其无促进肿瘤血管生成的作用，则可在化疗时应用Cp保护心肌，减轻化疗药物的心脏毒性，提高化疗疗效及耐受性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Cp由海南海口奇力制药有限公司提供，临用时配制，用0.9%氯化钠溶液溶解配成质量浓度为16 mg/ml，再用.9%氯化钠溶液稀释至所需浓度。RT-PCR试剂盒为Fermentas公司产品，引物为上海生物工程公司产品，Rabbit Anti-Ⅷ Factor多克隆抗体(克隆系：bs-0434R)为北京博奥森公司产品。RPMI1640培养液购自GIBCO公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 细胞株与实验动物 S180肉瘤细胞株由河北医科大学第四医院科研中心传代培养，接种细胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(青霉素、链霉素各100 U/ml)，培养器皿置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中昆明小鼠购自河北省实验动物中心[动物许可证编号：SCXK(冀)2012-1-003]。8周龄，雄性，体重18～22 g，饲养于SPF级实验室。

1.3 荷瘤鼠模型建立 小鼠肉瘤S180瘤株，腹腔传代接种，将接种7 d后腹水形成满意的肉瘤小鼠脱颈椎处死，置75%的乙醇浸泡5 min消毒，无菌操作抽取腹水(乳白色黏稠液体)，加入0.9%氯化钠溶液，1 000 r/min，离心5 min，倾出上清液，如此反复洗涤3次。台盼蓝染色并计数，将肿瘤细胞用0.9%氯化钠溶液调整成浓度为1×107/ml，活细胞数98%以上，符合接种要求。取60只小鼠，每只右腋皮下注射0.2 ml(含2×106个瘤细胞)S180肉瘤细胞悬液。24 h后开始腹腔注射用药，将60只昆明小鼠按随机分组方法分为4组，0.9%氯化钠溶液对照组(对照组)、Cp低、中、高剂量组，每组15只，共4组。低、中、高剂量组分别予以磷酸肌酸钠注射液200、400、800 mg/kg腹腔注射，对照组予以0.9%氯化钠溶液，每只0.2 ml，连续给药7 d，第10天脱颈椎法处死小鼠，剥取瘤体称重，按公式计算抑瘤率：抑瘤率=(对照组平均瘤重-试验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。将部分标本固定于70%乙醇，用于流式细胞术检测；部分标本液氮保存，用于分子生物学检测；部分固定于10%甲醛溶液，用于免疫组织化学检测。

1.4 流式细胞术检测肿瘤细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-2)蛋白的表达 网搓法制备单细胞悬液，取0.1 ml 单细胞悬液(含1×106个细胞)，分别加入1∶100 稀释的MMP-2和TIMP-2抗体0.1 ml，室温孵育30 min，加入PBS10 ml洗涤1次，弃上清，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 1.0 ml，经500目铜网过滤后上机检测。分别设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的同型对照。各蛋白表达量以平均荧光强度(均道值)表示。

1.5 RT-PCR法检测肿瘤细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA的表达 小鼠瘤组织总RNA提取按Invitrogen公司Trizol试剂说明书进行，紫外分光光度计检测浓度。反转录过程按Fementas公司生产的K1622试剂盒说明书进行。PCR反应体系共25 μl，包含cDNA 2 μl；上游引物2.5 μl；下游引物2.5 μl；绿色体系(含TaqDNA聚合酶、MgCl2等)12.5 μl；DEPC水5.5 μl。VEGF反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，进行35个循环后，72℃延伸7 min。bFGF反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，48.2℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环后，72℃延伸7 min。β-actin反应条件与VEGF相同。目的基因和β-actin各4 μl EB染色在1.5%琼脂糖凝胶上以80V电压直流电泳，紫外光下成像并拍照，并用Gel-proAnalyzer3.1软件分析扩增产物的光密度值(D)，计算相对系数(相对系数=目的基因D值/β-actin D值)作为目的基因mRNA表达的相对值，对目的基因进行光密度半定量分析。实验重复3次。见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 免疫组化法测定肿瘤组织内微密度(MVD)的表达 免疫组化采用S-P法：10%中性甲醛固定肿瘤组织，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm连续切片，二甲苯及乙醇梯度脱蜡至水，PBS冲洗2次，5 min/次，按抗体说明书要求进行抗原修复，蒸馏水冲洗2次，5 min/次，甲醇过氧化氢修复20 min。5%正常山羊血清封闭，37℃恒温箱中孵育45 min，滴加MVD一抗，染色步骤按试剂盒说明进行，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。MVD的稀释浓度为1∶200。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。抗-Ⅷ因子抗体标记的微血管密度(MVD)计数按Weider[5]推荐方法：先在低倍镜下选择微血管密度最高的区域，在肿瘤区域内凡染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为一个血管计数，在400倍视野下计数4个视野中的微血管数目，取平均数为该例的MVD值。

2 结果

2.1 Cp对S180肉瘤细胞小鼠移植瘤生长的作用 肿瘤细胞接种5 d后，各组小鼠均观察到移植瘤生长，瘤体呈圆形。实验结束时，各试验组移植瘤的重量均小于对照组，但低、中剂量组和对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组和各组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。Cp对小鼠移植瘤生长在一定范围内呈量效关系。见表2。

表2 Cp对小鼠S180肉瘤小鼠移植瘤生长的作用

注：与对照组比较，*P<0.01；与高剂量组比较，#P<0.05

2.2 Cp对移植瘤组织中VEGF、bFGFmRNA表达的影响 以β-actin为内参，Cp低、中剂量组和对照组比较，VEGF和bFGFmRNA的表达量有减小趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；Cp高剂量组和对照组、Cp低、中剂量组3组之间相比， VEGF、bFGFmRNA表达量明显减少，与3组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结果示高剂量的磷酸肌酸可抑制肿瘤VEGF、bFGFmRNA的表达。见表3、图1。

组别剂量(mg/kg)VEGFbFGF对照组 00.3898±0.00250.1602±0.0059低剂量组2000.3813±0.0114#0.1556±0.0038#中剂量组4000.3783±0.0089#0.1548±0.0041#高剂量组8000.3238±0.0115*0.1393±0.0029*

注：与对照组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，#P<0.05

2.3 Cp对移植瘤组织中MMP-2、TIMP-2蛋白的表达Cp低、中剂量组和对照组比较，MMP-2蛋白的表达量有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；TIMP-2表达蛋白有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。Cp高剂量组和对照组、Cp低、中剂量组3组之间相比，MMP-2蛋白的表达量明显降低，TIMP-2表达蛋白明显增高，与3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结果示高剂量的磷酸肌酸可下调MMP-2的表达、上调TIMP-2的表达。见表4,图2、3。

图1 RT-PCR检测各组小鼠移植瘤中VEGF、bFGF mRAN表达

注：1:对照组 2:低剂量组 3:中剂量组 4:高剂量组 M:标记

组别剂量(mg/kg)MMP-2TIMP-2对照组0386.47±2.25276.59±7.96低剂量组200382.41±5.08#284.45±3.76#中剂量组400378.52±8.89#286.32±10.41#高剂量组800323.10±9.27*308.90±14.50*

注:与对照组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，#P<0.05

2.4 Cp对移植瘤组织中MVD表达的影响 Cp低、中剂量组和对照组比较，MVD差异无统计学意义(P>0.05)；Cp高剂量组和对照组、Cp低、中剂量组比较，MVD间差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明高剂量的磷酸肌酸可抑制肿瘤血管生成。见表5、图4。

表5 Cp对移植瘤组织中MVD表达的影响 ±s

注：与对照组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，#P<0.05

3 讨论

Cp是参与细胞能量代谢的重要物质之一，在1927年被发现，Cp在细胞中的含量可高达2～30 mmo/L,当机体消耗三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)过多而致二磷酸腺苷增多时，磷酸肌酸将高能磷酸键转给二磷酸腺苷，二磷酸腺苷在腺苷酸激酶催化下转变成ATP被利用。因此，它是心肌、骨骼肌、脑、视网膜、肾和精子等这些高耗能细胞器官或细胞内ATP浓度恒定的“缓冲库”，这些器官或细胞的共同特点是，在生命活动中要消耗大量ATP，所耗ATP的补充要靠胞内的Cp来转化。生物体内能量的储存和利用都以ATP为中心，其是直接的供能物质，Cp是能量储备库，其含量的多少直接影响体内ATP水平。Cp在肌肉收缩的能量代谢中发挥重要作用，是心肌的能量储备，当心肌ATP供应不足时，储存的Cp就迅速动员出来用于ATP的合成，ATP的水解为肌动蛋白收缩过程提供能量；另外，Cp可以保护心肌细胞膜；促进心肌微循环；抑制5-核苷酸酶的活性，稳定心肌细胞内腺苷酸含量。可见，Cp是一种疗效非常明显的心肌保护剂，而化疗作为肿瘤治疗重要手段之一，其心脏毒性一直是化疗的最明显的副作用之一，限制了化疗的疗效，如果化疗时使用Cp减轻化疗药物的心脏毒性，那么就有可能大大提高化疗疗效，但Cp对肿瘤血管生长具有促进抑或抑制作用还尚未见研究报道，因此，我们建立了小鼠移植性S180肉瘤模型，来探讨磷酸肌酸对小鼠移植性S180肉瘤作用血管生长及其可能的机制。

图2 1:对照组 2:低剂量组 3:中剂量组 4:高剂量组

图3 1:对照组 2:低剂量组 3:中剂量组 4:高剂量组

图4 1:对照组 2:低剂量组 3:中剂量组 4:高剂量组(S-P，×400)

研究表明，肿瘤的生长和转移是血管依赖性的，实体瘤长到2～3 mm时，如果没有新生血管生成，肿瘤细胞即进入休眠状态，阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略这一学说。针对血管生成的治疗策略，已成为目前肿瘤治疗的热点研究领域。反映肿瘤血管生成的主要指标是检测肿瘤组织内VEGF， bFGF的表达量和MVD值。VEGF具有特异性促内皮细胞有丝分裂特性，与其受体结合能引起肿瘤血管内皮细胞增殖，迁移和管状结构的形成[6,7]。bFGF是最早被证实的血管生成因子之一，其体内外促血管生成作用已被公认，不仅参与肿瘤血管生成，且能促进肿瘤细胞生长，抑制细胞凋亡[8]。第八因子相关抗原是血管内皮细胞较特异性标记物，其表达量的高低反映肿瘤血管的多少；TIMP-2是内源性抗血管生成物质，可抑制血管内皮细胞迁移和由血管刺激因子所致的血管管状形成，并可预防肿瘤细胞的扩散。MMP-2是溶解血管外基质的主要蛋白溶解酶，是金属离子依赖性的内源性肽酶，能降解几乎所有的基底膜和细胞外基质，在肿瘤血管生成和肿瘤转移中起着重要作用[9]。

实验结果显示,对照组、Cp低剂量组和中剂量组3组之间各检测指标差异均无统计学意义(P>0.05)；Cp高剂量组和对照组、Cp低、中剂量组比较，小鼠移植性肉瘤质量明显减小，MMP-2蛋白显著减少及TIMP-2蛋白显著增加，MVD数显著减少，VEGF及bFGF mRNA明显减少。实验表明Cp低、中剂量对肿瘤血管生成无明显影响；Cp高剂量对肿瘤血管生成具有明显的抑制作用。其机制可能与三磷酸腺苷和Cp在体内的相互转换有关。ATP是体内重要的生物活性物质，参与体内的多种生理功能。近几年，学者们对其抗肿瘤作用展开了较多研究。Palomares等[10]研究表明ATP 对小鼠黑素瘤具有抗增殖作用；ATP主要通过特异性P受体发挥作用，P受体被核苷酸类物质如 ATP 选择性激活。当机体补充了Cp后，Cp将高能磷酸键转给二磷酸腺苷，二磷酸腺苷在腺苷酸激酶催化下由转变成ATP，结果是体内有较多的ATP积累，ATP具有抗肿瘤增殖的作用，从而可能通过ATP下调MMP-2、VEGF和bFGF表达量、上调TIMP-2表达量，发挥抗肿瘤血管生成的作用。

本实验结果显示，低剂量的Cp对肿瘤血管生成无影响，高剂量的Cp抑制肿瘤血管生成，其机制可能是Cp通过在体内转换为ATP，下调MMP-2、VEGF和bFGFmRNA表达量、上调TIMP-2表达量，发挥抗肿瘤血管生成的作用。因此，Cp可用于化疗的心肌保护。但此实验仅为动物实验，有待于临床观察验证。

1 贺利平，赵兴胜．磷酸肌酸在心血管疾病中的应用．中国心血管病研究，2013，11：803-805．

2 Azova MM,Blagonravov ML,Frolov VA.Effect of phosphocreatine and ethylmethyl hydroxypyridine succinate on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in left-ventricular cardiomyocytes of spontaneously hypertensive rats.Bull Exp Biol Med,2015,158:313-314.

3 Rana A,Sharma S.Mechanism of sphingosine-1-phosphate induced cardioprotection against I/R injury in diabetic rat heart:Possible involvement of glycogen synthase kinase 3β and mitochondrial permeability transition pore.Clin Exp Pharmacol Physiol,2016,43:166-173.

4 Zhang W,Zhang H,Xing Y.Protective effects of phosphocreatine administered post-treatment combined with ischemic post-conditioning on rat hearts with myocardial ischemia/reperfusion injury.J Clin Med Res,2015,7:242-247.

5 Weider N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density with breast carcinoma and solid tumors.Breast Cancer Res Treat,1995,36:169-180.

6 Chauvet N,Romanò N,Lafont C,et al.Complementary actions of dopamine D2 receptor agonist and anti-vegf therapy on tumoral vessel normalization in a transgenic mouse model.Int J Cancer,2017,140:2150-2161.

7 Shirali S,Barari A,Hosseini SA,et al.Effects of Six Weeks Endurance Training and Aloe Vera Supplementation on COX-2 and VEGF Levels in Mice with Breast Cancer.Asian Pac J Cancer Prev,2017,18:31-36.

8 Horikoshi-Ishihara H,Tobita M,Tajima S,et al.Coadministration of adipose-derived stem cells and control-released basic fibroblast growth factor facilitates angiogenesis in a murine ischemic hind limb model.J Vasc Surg,2016,64:1825-1834.

9 Zhai LL,Wu Y,Huang DW,et al.Increased matrix metalloproteinase-2 expression and reduced tissue factor pathway inhibitor-2 expression correlate with angiogenesis and early postoperative recurrence of pancreatic carcinoma.Am J Transl Res,2015,7:2412-2422.

10 Palomares T,Bilbao P,del-Olmo M,et al.In vitro and in vivo comparison between the effects of treatment with adenosine triphosphate and treatment with buthionine sulfoximine on chemosensitization and tumorgrowth of B16 melanoma.Melanoma Res,1999,9:233-242.

Effects of creatine phosphate on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma and its possible mechanism

HANWenfeng,WEISuju,ZHENGYazhen.

DepartmentofOncology,TheSeventhPeople’sHospitalofHebeiProvince,Hebei,Dingzhou073000,China

Objective To investigate the effects of creatine phosphate (Cp) on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma, and to explore its related action mechanism.Methods The animal models with S180 sarcoma were established in Kunming mice.The 60 mice were randomly divided into four groups:control group,low-dose group (Cp 200mg/kg),middle-dose group (Cp 400mg/kg), high-dose group (Cp 800mg/kg).The changes of transplanted tumors weight were observed,moreover, the expression levels of (matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-2) protein in transplanted sarcoma tissues were detected by flow cytometry,and the microvessel density (MVD) of tumors was detected by immunohistochemistry (IHC),besides the expression levels of VEGF and bFGF mRNA in transplanted tumor were detected by RT-PCR.Results There were no significant differences in transplantation tumor weight,the expression levels of VEGF,bFGFmRNA,MMP-2,TIMP-2 among control group,low-dose group and middle-dose group (P>0.05). However the transplantation tumor weight in high-does group was significantly decreased,as compared with those in control group, low-dose group and middle-dose group,moreover MVD was obviously decreased,and the expression levels of VEGF, bFGFmRNA and MMP-2 protein were significantly decreased,however,the expression levels of TIMP-2 protein were significantly increased (P<0.01).Conclusion The low-dose and middle-dose Cp has no obvious inhibitory effects on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma, however high-dose Cp has obvious inhibitory effects on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma, and its action mechanism might be correlated to down-regulation of expression levels of MMP-2,VEGF,bFGF and up-regulation of TIMP-2 expression.

creatine phosphate; S180 sarcoma; VEGF; bFGF; MVD

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.002

073000 河北省定州市，河北省第七人民医院肿瘤科

R 73-3

A

1002-7386(2017)14-2090-05

2017-01-18)