高产淀粉酶菌株的筛选及其培养条件的优化

张志强+李思思+李辉+梁魁景+刘言+王婷婷+由明扬

摘要：为筛选淀粉酶高产菌株，通过比较水解圈与菌落的直径比及3，5-二硝基水杨酸（DNS）显色法所测酶活性高低，筛选得到高产淀粉酶能力的菌株WB-4。通过单因素试验，得到该菌株的最优碳源为可溶性淀粉，最优氮源为蛋白胨。利用Plackett-Burman进行显著因素筛选，发现可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、温度为显著因素。利用响应面法对显著因素进行优化，得到菌株的最优培养条件为可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，温度 31.12 ℃，淀粉酶活性 365.12 U/mL，酶活性提高了1.33倍。

关键词：高产淀粉酶菌株；响应面法；Plackett-Burman因素筛选；发酵条件优化；工业化应用

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0221-03

淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称[1]。淀粉酶来源极其广泛，不仅动物的唾液、胰脏富含淀粉酶，植物体内也含有丰富的淀粉酶，但是，目前商业化生产的淀粉酶主要由微生物发酵提炼所得[2]。自从19世纪初德国科学家Kirchhoff发现淀粉酶以来，有关淀粉酶的研究报道逐年增加，淀粉酶的应用也越来越广泛。特别是在酿造工业、纺织、医药工业、环保、洗涤剂等方面得到了广泛的应用[3]。近年来，虽然我国淀粉酶的品种、产量不断增加，但是与国外相比，我国的淀粉酶品种相对偏少、产量偏低[4]。为了适应经济快速发展对淀粉酶的需求，本试验对河北省衡水市周边采集到的样品进行分离筛选，并利用响应面法进一步提高其产量，以期为淀粉酶的工业化应用提供支持。

1材料与方法

1.1样品

试验所用样品采集地点为河北省衡水市某面粉厂、某食品加工厂、某学校食堂。

1.2培养基

筛选培养基：10 g/L蛋白胨，3 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，2 g/L 可溶性淀粉，20 g/L琼脂，加蒸馏水至1 000 mL，调节pH值为7.0～7.2。

摇瓶发酵培养基：除不加琼脂外，其他成分同筛选培养[LL]基。

1.3试验方法

1.3.1产淀粉酶菌株的筛选初筛：取1 g不同地点采集的样品溶解于9 mL灭菌蒸馏水中，然后进行梯度稀释，直到10-7稀释度为止。取0.1 mL不同稀释倍数的样液涂布到筛选培养基上，30 ℃培养数天，划线纯化，直到获得单菌落为止。将得到的单菌落接种到筛选培养基上，30 ℃培养2～4 d，经碘液染色后根据水解圈的大小，初步筛选出产淀粉酶的菌株。

复筛：将初筛到的菌株接种到摇瓶发酵培养基上，30 ℃、120 r/min摇床培养48 h。将发酵液于5 000 r/min离心 10 min，取上清液测定酶活性，选取酶活性较高的菌株作为试验菌种。

1.3.2发酵条件的优化

1.3.2.1单因素试验在摇瓶发酵培养基中，分别加入05%不同碳源（麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、乳糖）替换其碳源成分，进行碳源优化试验。在最优碳源的基础上，分别以不同氮源（硝酸铵、尿素、硫酸铵、胰蛋白、牛肉膏、蛋白胨）替换培养基中氮源成分，进行氮源优化试验。

1.3.2.2筛选显著因素用Design Expert 7.0软件中的Plackett-Burman对可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、牛肉膏含量、温度、转速、装液量、初始pH值等7个因素进行设计，每个因素分别按低水平（-1）、高水平（+1）进行设计（表1），

1.3.2.3响应面法优化以“1.3.2.2”节筛选到的显著因素为基础，利用中心组合设计原理，对选取的显著因素从5个水平进行考察，确定最优条件，并验证其准确性。

1.3.3淀粉酶活性测定淀粉酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[5]。酶活性单位定义：1 U（单位酶活）表示在试验条件下1 min释放出1 μmol还原糖需要的酶量。

2结果与分析

2.1菌株的筛选

样品经涂布及多次纯化后，将得到的单菌落接种到筛选培养基上，进行淀粉酶水解圈试验。经初步筛选共有32株菌株产生了透明圈，其中水解圈/菌落直径比（即D/d值）大于2的菌株共有8株，分别命名为WB-1、WB-2、WB-3、WB-4、WB-5、WB-6、WB-7、WB-8；D/d值最大的为 WB-3，其次为WB-4，再次为WB-2（表2）。因此，初步筛选这3株菌株进行复筛。

将初筛得到的3个菌株WB-2、WB-3、WB-4接种到摇瓶发酵培养基上培养一定时间后，进行酶活性测定。结果显示，WB-2、WB-3、WB-4的酶活性分别为126.4、137.3、156.5 U/mL。水解圈的大小在一定程度上可以反映酶活性的高低，但是却不能完全代表菌株產酶能力的强弱，其原因可能是不同菌株在生长、产酶速度上存在差异、菌苔的大小及其在平板上的堆积情况存在差异，此外，还有可能是由于固体培养基、液体培养基的培养条件存在差异等[6]。因此，在选择菌株时不能以水解圈的大小作为唯一标准。虽然WB-4的 D/d 值小于WB-3，本试验综合考虑水解圈大小及产酶能力的高低，最终选择WB-4作为目的菌株。

2.2发酵条件的优化

2.2.1单因素试验用6种不同碳源替换摇瓶发酵培养基中的碳源，于30 ℃、120 r/min培养48 h，测定上清液淀粉酶活性。从图1可以看出，以可溶性淀粉作为碳源时，酶活性最高，乳糖次之，甘油最低，因此选择可溶性淀粉作为碳源。

用6种不同氮源替换摇瓶发酵培养基中的氮源，于 30 ℃、120 r/min培养48 h，测定上清液淀粉酶活性。从图2可以看出，以蛋白胨作为氮源时，淀粉酶活性最高，以牛肉膏作为氮源时也能取得较好的效果。而以硫酸铵、硝酸铵、尿素等无机物质作为氮源，产酶效果较差。因此，本试验选择蛋白胨作为氮源。

2.2.2显著因素的筛选利用Design Expert 7.0软件中的Plackett-Burman对7个因素进行设计，具体方案及结果见表3、表4。一般认为P值>F值小于0.05，说明该因素为显著因素。由表4可以看出，可溶性淀粉含量、蛋白胨含量及温度的P值>F值的值分别为0.006 2、0.046 1、0.015 0，说明这3个因素为显著因素，因此选择可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、温度进行进一步的优化试验。

2.2.4验证模型的可靠性通过该模型拟合得出生产淀粉酶的最佳培养条件：可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，温度31.12 ℃，预测最高淀粉酶活性为 371.89 U/mL。在最佳培养条件下得到的淀粉酶活性为 365.12 U/mL，与预测的最佳淀粉酶活性相差很小，说明该模型可用于淀粉酶发酵条件的优化。

3结论

笔者所在课题组对河北省衡水市周边采集到的样品进行筛选。在综合考虑初筛及复筛的结果后，决定将WB-4作为

目的菌株进行发酵条件的优化。对菌株进行单因素优化，发现最优碳源为可溶性淀粉，最优氮源为蛋白胨。在单因素优化的基础上，利用Plackett-Burman确定了可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、温度为显著因素。利用响应面法对3个显著因素进行优化，通过分析显著因素与酶活性之间的关系，建立了两者之间的数学模型，通过响应面法的分析得到最优培养条件为可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，培养温度 31.12 ℃，预测最高酶活性为371.89 U/mL，实测值为 365.12 U/mL，相差较小，说明优化结果可信。通过优化使得淀粉酶活性由最初的156.5 U/mL提高到365.12 U/mL，提高了1.33倍，效果明显，为该菌株的工业化应用提供了有力的支持。

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江苏农业科学2017年第45卷第10期

[SQ*5]

[HT6F]施磊，扶教龙，吴晨奇，等. 产辅酶Q10根瘤土壤杆菌的紫外诱变选育及其发酵培养基优化[J]. 江苏农业科学，2017，45（10）：224-228.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.10.062

产辅酶Q10根瘤土壤杆菌的紫外诱变选育及其发酵培养基优化

施磊， 扶教龙， 吴晨奇， 钱大伟， 徐敏强， 鞠鑫， 李良智

（苏州科技学院化学生物与材料工程学院，江苏苏州 215009）

摘要：以根瘤土壤杆菌作为出发菌株，经过紫外诱变、平板初筛、摇瓶发酵复筛，最终获得1株辅酶Q10高产菌株 Q-6，其辅酶Q10产量为11.92 mg/L，较出发菌株提高92.57%，且其遗傳性稳定，可用于进一步研究。然后在单因素试验的基础上，应用响应面分析方法，对其发酵培养基进行优化，得到生产辅酶Q10的最佳发酵培养基配方（葡萄糖35.46 g/L、酵母浸膏12.33 g/L、Na2HPO4 1.58 g/L、MgSO4·7H2O 0.39 g/L），在此培养基下辅酶Q10产量最高，为1132 mg/L，较单因素试验最高值提高8.53%。

关键词：根瘤土壤杆菌；辅酶Q10；紫外诱变；响应面分析法；发酵培养基

中图分类号： Q935文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0224-05

辅酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）别称癸烯醌、泛醌，它是人类生命不可缺少的重要元素之一，能激活人体细胞，同时还能提高人体免疫力并增强人体活力，现在医学上广泛用于心血管系统疾病的治疗[1]，除此之外，辅酶Q10还具有抗氧化性、延缓衰老和增强人体活力等功能，所以现在它已经在食品和化妆品领域得到大量应用。辅酶Q10的制备有化学法、动植物组织提取法和微生物发酵法3种方法[2-4]。因为使用前2种方法合成辅酶Q10时的成本较高，并且会产生光学异构体，生物学活性也不是很高，所以现在微生物发酵法被认为是最具有前途的一种生产方式。本试验选择根瘤土壤杆菌为出发菌株，该菌是目前研究CoQ10生物发酵法较常用的菌种[5-7]。通过紫外照射诱导变异和平板初筛、摇瓶发酵复筛相结合的方法，以期获得CoQ10高产菌，为提高CoQ10工业生产效率打下基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种与试剂

根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens 1.1701）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏于笔者所在试验室。辅酶Q10标准品（美国Sigma 公司），分析纯。其他药品和试剂，均为分析纯或化学纯。

1.1.2培养基

（1）平板培养基。葡萄糖5 g/L，酵母膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2，121 ℃灭菌20 min。（2）斜面培养基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.2，121 ℃灭菌20 min。（3）种子培养基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，pH值7.2，121 ℃灭菌20 min。（4）发酵培养基。葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Na2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，pH值7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3试验设备

紫外分光光度计（UV-2450，日本岛津）；可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；恒温调速回转式摇床（上海跃进医疗器械厂）；数显pH计（上海天达仪器有限公司）；生物传感分析仪等。

1.2方法

1.2.1菌种活化

将保存的原始菌株接种于斜面培养基上，将接种后的斜面试管置于恒温培养箱中，30 ℃下培养48 h，之后再进行第2、第3次传代培养，放入冰箱冷藏待用。

1.2.2种子液培养

用接种环从斜面培养基中接1环菌种于种子培养基中，将接好种的三角瓶放入摇床中，在30 ℃、200 r/min条件下培养24 h，种子培养基为250 mL锥形三角瓶中装入50 mL培养基。

1.2.3摇瓶发酵培养

摇瓶发酵培养是将培养好种子培养液按10%（体积分数）接种量的接入装有50 mL发酵液的 250 mL 三角瓶中，在30 ℃、200 r/min条件下摇床培养72 h，发酵结束后进行相关参数测定。

1.2.4皂化法提取辅酶Q10

将菌体移入250 mL磨口锥形瓶内，在锥形瓶中加入2.5 g KOH、0.7 g焦性没食子酸、19 mL 甲醇、7mL蒸馏水，然后混匀，在90 ℃水浴锅中回流 30 min，用自来水迅速冷却到常温，倒入分液漏斗中，在分液漏斗中加入40 mL石油醚，剧烈振荡5 min，进行辅酶Q10的萃取，连续萃取2次，最后把萃取液合并，用蒸馏水洗涤到中性；然后加入5 g无水硫酸钠，干燥并使液体澄清；再用50 ℃的旋转蒸发仪浓缩至干，并且完全挥发，再加入5 mL无水乙醇，放入冰箱中冷冻，使胆固醇等杂质析出，过滤，滤液定容至 10 mL，进行测量。

1.2.5辅酶Q10产量的测定

参照紫外分光光度法[8]。

1.2.6菌株生长曲线的绘制

进行紫外诱变时，通常在细胞对数期进行紫外照射导致发生突变的概率较大，因此须要确定出发菌株的生长曲线。吸取5 mL生理盐水注入活化好的根瘤土壤杆菌斜面种子中，用竹签或接种针将菌落刮下，将菌悬液转移至空试管中用振荡器混匀，从中吸取1 mL菌悬液（按2%接种量）接种到50 mL种子培养基中，于30 ℃、200 r/min 条件下摇床培养，每间隔2 h 取9 mL种子液于事先已称好的10 mL离心管中，于4 000 r/min下离心15 min。洗涤后离心，重复2次，烘干测干质量，并且计算菌体浓度。将各时段的菌体浓度作为纵坐标，培养时间作为横坐标，绘制出发菌株的生长曲线。

1.2.7紫外诱变方法

1.2.7.1菌悬液的制备

取10 mL处于对数生长期（培养12 h）的发酵液，加入进无菌离心管中，10 000 r/min下离心20 min，去除上清液，收集菌体，菌体用10 mL生理盐水洗涤离心3次，然后重新悬于10 mL无菌生理盐水中，备用。使用血球计数板，在显微镜下直接计数，将细胞浓度调整为“亿个/mL”。

1.2.7.2紫外诱变

开启20 W的紫外线灯预热10～15 min，取3 mL制备好的菌悬液，置于1个直径为6 cm的空培养皿中，将培养皿放在离紫外灯30 cm的地方，分别振荡照射0、30、60、90、120、150、180 s，然后在黑暗中分别取0.1 mL处理菌液涂布于平板培养基上，用黑纸包好，30 ℃下倒置培养48 h，计数，绘制致死率曲线。同时，作对照试验，对照组菌悬液不进行紫外照射，其他操作相同。致死率[9]计算公式为：致死率=（对照菌落数-处理菌落数）/对照菌落数×100%。在正式试验时，选取致死率为80%的处理时间进行诱变，其余操作同上。

1.2.7.3初筛

根据致死率曲线，将诱变后的菌液涂布于筛选平板培养基上，30 ℃下培养48 h；挑取生长快、菌落大的单菌落，接入斜面，30 ℃培养48 h，置于4 ℃冰箱保藏，以备复筛。

1.2.7.4复筛

将初筛得到的突变株菌株逐个接入种子培养基中，于30 ℃、200 r/min摇床中培养24 h，然后按10%接种量转接到发酵培养基中，30 ℃、200 r/min培养72 h，离心收集菌体，利用醇碱皂化法提取辅酶Q10，测定菌体生物量及辅酶Q10产量。

1.2.7.5突变株稳定性试验

利用斜面培划线接种进行传代试验，30 ℃下培养48 h；分别测定第2、第4、第6代的辅酶Q10产量，比较其产辅酶Q10的稳定性。

1.2.8发酵培养基优化

1.2.8.1发酵培养基的单因素试验

本试验选择培养基中对发酵影响最大的葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4·7H2O 等4种成分，分别考察其不同浓度对诱变菌株发酵产辅酶Q10的影响。其中，葡萄糖浓度为10、20、30、40、50 g/L，酵母膏浓度为5、7.5、10、12.5、15 g/L，Na2HPO4浓度为1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 g/L，MgSO4·7H2O浓度为0.3、0.4、0.5、06、0.7 g/L。

1.2.8.2发酵培养基优化的响应面分析试验

根据单因素试验结果，选用葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4·7H2O为考察因素，采用Design-Expert软件[10]中的中心组合设计（central composite design，CCD），设计4因素5水平的响应面分析[11]试验，其试验因子和编码水平见表1。

2结果与分析

2.1生长曲线

从图1可以看出，出发菌株在4 h后开始进入对数期，18 h 后进入稳定期。处于对数期的细胞中DNA复制较为活跃，对各种理化刺激较为敏感，出现突变的概率较大，因此选取4～18 h的细菌培养液进行紫外诱变出现变异的概率较大。

2.2紫外照射致死率曲线

从图2可以看出，当辐照时间为120 s时，约97%的根瘤土壤杆菌致死。这几年通过对紫外线诱变效应的研究发现，提高产量的正向突变较多地出现在偏低的剂量中，而负突变则较多地出现在偏高的剂量中[12]。因此，本研究选取的诱变剂量为紫外线照射60～90 s，致死率约为70%～83%，此时发生正向突变的概率较大。

2.3紫外诱变菌株筛选结果

将经过紫外诱变[13]处理后的菌悬液直接涂布于平板上，在30 ℃培养箱中培养48 h，从平板上挑取27株生长良好的单菌落，对这27株菌株进行摇瓶复筛，测定辅酶Q10产量，筛选结果见图3。从图3可以看出，有7株突变株辅酶Q10的产量有所提高，正突变率约为26%。其中，6号突变株Q-6表现最突出，辅酶Q10的产量达到11.92 mg/L，较出发菌株提高了9251%，诱变结果最好，所以选择突变株Q-6进行遗传稳定性研究。

2.5发酵培养基的优化

2.5.1葡萄糖浓度对辅酶Q10产量的影响

从图4可以看出，随葡萄糖浓度的增加，辅酶Q10产量增大，当葡萄糖浓度达到30 g/L时，辅酶Q10产量达到最大，为（10.05±0.301 5）g/L；当葡萄糖浓度继续加大时，辅酶Q10产量反而下降，这可能是由于在发酵过程中添加过多葡萄糖而引起的“葡萄糖效应”，进而影响菌体生长和代谢产物的形成。因此，确定本试验葡萄糖浓度为30 g/L。

2.5.2酵母膏浓度对辅酶Q10產量的影响

从图5可以看出，当酵母膏浓度低于12.5 g/L时，辅酶Q10产量不断增大；当酵母膏浓度达到12.5 g/L时，辅酶Q10产量达到最大，产量为（10.42±0.312 6）g/L；当葡萄糖浓度继续加大时，辅酶Q10产量反而下降，这可能是由于酵母膏成分复杂，在发酵后期底物消耗不完，某些成分抑制菌体生长及产物的合成。所以，酵母膏浓度定为12.5 g/L。

2.5.3Na2HPO4浓度对辅酶Q10产量的影响

从图6可以看出，当Na2HPO4浓度为1.6 g/L时，产量达到最大，此时辅酶Q10产量为（10.43±0.312 9）g/L；但继续加大Na2HPO4浓度时，辅酶Q10产量逐渐下降，这表明过多的Na2HPO4并不利于提高辅酶Q10产量，只有适宜的Na2HPO4浓度才有利于辅酶Q10的形成。所以，在本试验考察范围内，Na2HPO4最佳浓度为1.6 g/L。

2.5.4MgSO4· 7H2O浓度对辅酶Q10产量的影响

从图7可以看出，辅酶Q10产量随MgSO4·7H2O浓度的升高，先升高后降低，并当MgSO4·7H2O浓度达到0.4 g/L时，辅酶Q10产量达到最大，此时产量为（10.23±0.306 9）g/L。这可能是由于较低浓度的Mg2+能够促进辅酶Q10的形成，而当浓度达到一定高度时，又会抑制辅酶Q10的形成。所以，本试验可把MgSO4·7H2O浓度定为0.4 g/L。

2.5.5响应面设计优化发酵培养基组成

2.5.5.1模型的建立及显著性检验

根据单因素结果，采用Design-Expert软件对葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4· 7H2O的浓度进行优化，试验结果如表3所示。

用Design-Expert软件对表3数据进行多元回归拟合，可以得到辅酶Q10

[FK（W+45mm][TPSL77.tif]

产量（Y）对葡萄糖浓度（A）、酵母膏浓度（B）、Na2HPO4浓度（C）、[CM（23*2]MgSO4· 7H2O浓度（D）的回归方程为：Y=-49.20+

0.50A+2.60B+32.82C+49.17D+5.20AB-0.07AC-003AD+0.29BC-0.23BD-2.67CD-5.50A2-012B2-10.43C2-52.85D2，对试验结果进行显著性检验及方差分析，结果如表4所示。

对模型进行回归方程系数显著性检验可知，一次项D（MgSO4· 7H2O浓度），交互项AC、BC对辅酶Q10产量影响显著，平方项A2、B2、C2、D2对辅酶Q10产量影响极显著。模型P值<0.000 1，是极显著的，而失拟项的P值=0.789 2，是不显著的，说明该方程的拟合度较好；模型的决定系数R2=0.976 1，表明该模型能较好地预测发酵培养基组分与辅酶Q10产量的关系；模型的调整决定系数R2Adj=0953 7，表明方程模型可信度较高，能够较好地描述试验结果。

2.5.5.2响应面优化及分析

根据CCD试验设计结果作出三维响应面（图8至图13），它们分别反映了葡萄糖浓度（A）、酵母膏浓度（B）、Na2HPO4浓度（C）、MgSO4· 7H2O浓度（D）这4个因素的两两交互作用对产量的影响。

2.5.5.3优化培养基的验证

根据所得的模型，由响应面分析法求得优化后4种成分的最佳浓度为：葡萄糖35.46 g/L、酵母膏12.33 g/L、Na2HPO4 1.58 g/L、MgSO4· 7H2O 0.39 g/L，预测得到辅酶Q10最高产量为11.28 mg/L。为了证实试验结果的可靠性，按上述最终培养基参数进行验证试验，3次重复试验的辅酶Q10产量的平均值为11.32 mg/L，与预测值接近，表明模型是可行有效的，具有一定的实践价值。

[BT1-*8][STHZ]3结论

采用紫外诱变，经过平板初筛和摇瓶发酵复筛，最终获得1株辅酶Q10高产菌株Q-6，其辅酶Q10产量为11.92 mg/L，较出发菌株提高92.57%，且其遗传性稳定。在单因素试验的基础上，应用响应面分析，对其发酵培养基进行优化，得到生产辅酶Q10的最佳发酵培养基配方为：葡萄糖35.46 g/L、酵

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