响应面法对光合细菌还原亚碲酸盐条件的优化

易馨+杨开智+童晋+李明学+谢鸿观

摘要：以实验室前期获得的1株对亚碲酸盐有还原能力的光合细菌——沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）为研究对象，采用响应面法对其还原亚碲酸盐的条件进行优化。在单因素试验基础上，以碲的还原率为响应值，采用Box-Behnken（BB）设计，利用Design-Expert软件对响应值进行4因素3水平下的多元二次回归拟合分析，确定最佳还原条件为：菌种接种量8%（体积分数，下同），初始碲浓度63 mg/L，初始pH值6.2，接种后培养9 d，则亚碲酸盐的还原率可达99.76%。反应过程中还原条件的优化，对后期利用微生物治理环境的碲污染具有参考价值。

关键词：光合细菌；亚碲酸盐；最佳还原条件；响应面法；碲污染治理

中图分类号： Q939.9文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0217-04

碲（Te）是一种非金属稀散元素，于1782年在金矿中发现[1]。碲及其化合物广泛应用于冶金、化工、电子、医药等行业，被誉为“现代工业、国防与尖端技术的维生素”“当代高技术新材料的支撑材料”[2]。随着碲的广泛应用，对环境造成的污染也日益增加。

碲的化合物在很低的浓度水平都具有毒性，其中以亚碲酸盐（TeO32-）的毒性最强，是污染环境的主要物质之一。亚碲酸盐具有很好的水溶性且易于进入生物体内，其毒性远比单质碲的毒性强，主要是其具有氧化性[3]，而单质碲不溶于水，常被认为无生物利用性。将污染物中易溶有毒的亚碲酸盐还原成碲单质，从而可以达到去除这种元素的目的。微生物的这种作用在环境碲污染的治理方面具有应用前景。

响应面分析法（response surface analysis methodology，RSM）是目前广泛应用的一种综合试验设计和数学建模的优化方法，通过多元二次回归方程拟合多因子与响应值间的关系进行模型预测，并可得到最佳优化条件[4]。成都理工大学测试楼微生物实验室前期获得1株对亚碲酸盐有还原能力的光合细菌——沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris），本研究对其还原亚碲酸盐的影响条件进行系统研究，用响应面法分析确定了最佳还原条件，对后期利用微生物治理环境中的碲污染问题具有指导意义。

1材料与方法

1.1菌种

试验菌种为实验室前期储藏的1株对亚碲酸盐有还原能力的沼泽红假单胞菌。

1.2供试培养基

培养基采用RCVBN液体培养基，其配方如下：DL-苹果酸4.00 g，（NH4）2SO4 1.00 g，KH2PO4 1.36 g，K2HPO4·3H2O 1.24 g，MgSO4·7H2O 120 mg，CaCl2·2H2O 75 mg，EDTA 20 mg，維生素B1 1 mg，烟酸 1 mg，生物素 15 μg，微量元素 1 mL，双蒸水 1 L。微量元素包括H3BO3 2.8 mg、ZnSO4·7H2O 240 μg、MnSO4·H2O 1.6 mg、Cu（NO3）2·3H2O 40 μg、Na2MoO4·2H2O 750 μg，双蒸水 1 L。

1.3试验方法

1.3.1单因素试验优化亚碲酸盐还原条件

1.3.1.1菌种接种量的考察将初始碲浓度为60 mg/L的100 mL液体培养基用氢氧化钠溶液调pH值为7.0，分别按体积分数为1%、3%、5%、7%、9%、11%的接种量将在30 ℃下培养了5 d的沼泽红假单胞菌接种至培养基中，置于30 ℃光照培养箱中。

1.3.1.2初始碲浓度的考察将接种了5%沼泽红假单胞菌的液体培养液置于30 ℃光照培养箱中，培养5 d后将不同浓度的亚碲酸钠溶液加入培养基中，使其初始碲浓度分别为20、40、60、80、100、120、140 mg/L，初始pH值均为7.0。

1.3.1.3初始pH值的考察将初始碲浓度为60 mg/L的100 mL液体培养基用氢氧化钠溶液调pH值分别为5.0、55、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并将在30 ℃培养了5 d的沼泽红假单胞菌按5%接入培养基中混合，置于30 ℃光照培养箱中。

以上几组培养基均培养8 d后，用灭菌的针筒分别抽取上述菌液10 mL于洁净离心管中，置于高速离心机中离心分离（5 000 r/min，t=10 min），取上清液用一次性的0.22 μm滤膜过滤，并测定滤液中剩余碲的浓度。

1.3.1.4接种后培养时间的考察将初始碲浓度为 60 mg/L 的500 mL液体培养基用氢氧化钠溶液调pH值为7.0，并将在30 ℃培养了5 d的沼泽红假单胞菌菌株按5%接入培养基中混合，置于30 ℃光照培养箱中。培养至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 d时，分别用灭菌的针筒分别抽取菌液 10 mL 于洁净离心管中，置于高速离心机中高速离心分离（5 000 r/min，t=10 min），取上清液用一次性的0.22 μm滤膜过滤，并测定滤液中剩余碲的浓度。

1.3.2响应面法优化试验设计

对沼泽红假单胞菌的接种量、初始碲浓度、初始pH值及接种后培养时间（分别记为A、B、C、D），每个因素取3个水平；以Te4+的还原率作为响应值，记为R，进行Box-Behnken（BB）试验设计，建立数学模型，通过Design Expert软件对试验数据进行回归分析，预测最优还原条件，并按照预测最优还原条件重复试验，与模型的预测值进行比较，验证其有效性。

1.3.3碲还原率的测定

采用氢化物-原子荧光仪（HG-AFS）测定培养液中Te4+的浓度[5]。

[JZ]碲还原率=（A-B）/A×100%。

式中：A為初始碲浓度，mg/L；B为还原后培养基中Te4+浓度，mg/L。

2结果与分析

2.1细菌还原亚碲酸盐现象

沼泽红假单胞菌在未添加亚碲酸钠的液体培养基中培养8 d，结果如图1（右）所示，培养液由无色逐渐变成红色，这是细菌正常培养的颜色。而沼泽红假单胞菌在含亚碲酸钠的液体培养基中培养8 d，结果见图1（左），培养液颜色逐渐变为黑色，这是由于沼泽红假单胞菌将Na2TeO3还原成黑色单质碲的缘故。

2.2菌种接种量对亚碲酸盐还原率的影响

在不同的菌种接种量条件下，沼泽红假单胞菌对亚碲酸盐的还原率存在明显的差异，结果如图2所示。随着菌种接种量的增加，沼泽红假单胞菌对碲的还原率明显提高；当接种量达到5%时，还原率达到一个高值，为90.24%；随后再增加菌种接种量，碲的还原率变化不大，由此推测，当菌种接种量低于5%时，菌株在培养基中的生长速度相对缓慢，严重影响了碲的还原率，当菌种接种量≥5%时，对亚碲酸盐还原效果更好。

2.3初始碲浓度对亚碲酸盐还原率的影响

沼泽红假单胞菌在不同的初始碲浓度条件下培养，对碲的还原率如图3所示。随着初始碲浓度的增大，对碲的还原率呈现上升—下降的趋势。碲的还原效果在亚碲酸钠添加量低于 60 mg/L 时，碲还原率呈缓慢上升趋势，达到最大值（9098%），说明菌株可忍受一定浓度的亚碲酸盐，而未受到TeO32-的抑制且菌株活性良好。当初始碲浓度超过60 mg/L

时，随着碲浓度的升高，其较高的毒性抑制了菌的活性，碲还原率逐渐降低。

2.4pH值对亚碲酸盐还原率的影响

在不同的pH值条件下，菌株还原碲的效果如图4所示。当pH值为6.5～7.5时，碲还原效果较好，还原率为 90.09%～91.13%，因此试验中采用的沼泽红假单胞菌适宜的生长代谢pH值范围为6.5～7.5[6]。当pH值<6或pH值>8时，碲还原率相对较低。可见，过高或过低的pH值环境会直接影响菌的酶活性，抑制其生长和代谢能力，不利于菌株对亚碲酸钠的还原。

2.5接菌种后培养时间对亚碲酸盐还原率的影响

沼泽红假单胞菌接种后随着培养时间的变化，碲的还原率也存在明显的变化，结果如图5所示。接种培养的前7 d，随着菌的生长，培养液中的TeO32-浓度降低，碲还原率迅速增长。在培养后8 d，对亚碲酸盐的还原率达到一个高值，为89.09%；随后，随着时间的推移，碲还原率达到稳定期。这一[JP3]趋势与细菌在亚碲酸盐的胁迫下菌体的生长曲线相符合，说明沼泽红假单胞菌还原亚碲酸盐可能依赖菌体生物量的生长。

2.6Box-Behnken中心组合设计试验与响应面优化还原条件

2.6.1模型的建立及显著性检验

将菌种接种量、初始碲浓

2.6.3最佳还原条件的预测与检验

根据所建立的数学模型进行参数的最优化分析，得出沼泽红假单胞菌还原亚碲酸盐的条件为：菌种接种量8%，初始碲浓度63.29 mg/L，初始pH值 6.23，接种后培养9 d，在此条件下，亚碲酸盐的还原率在理论上可达107.38%。考虑到实际可操作性，将还原条件修正为：菌接种量8%，初始碲浓度63 mg/L，初始pH值 6.2，接种培养9 d。为验证试验结果的可靠性，在最优的还原条件下进行试验，6组平行试验的平均值为99.76%，试验结果与模型复合良好。因此，采用响应面分析法优化得到的沼泽红假单胞菌还原亚碲酸盐的条件参数准确可靠，具有利用价值。

3结论与讨论

利用微生物将溶解性强的亚碲酸盐还原成溶解性差、无毒的碲单质的报道有很多[7-10]，如Lloyd等利用大肠杆菌（Escherichia coli）对亚碲酸盐还原，发现碲单质积累在靠近细胞膜位置[7]；Klonowska等发现，希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）能够在厌氧条件下还原亚碲酸盐[9]。目前，对细菌还原亚碲酸盐影响条件的系统研究还较少。通过单因素试验和中心组合设计试验，采用响应面分析方法优化光合细菌还原亚碲酸盐影响条件，得到优化还原条件为：菌接种量8%，初始碲浓度63 mg/L，初始pH值 6.2，接种后培养9 d，在此条件下，亚碲酸盐的还原率可达99.76%。在此试验范围内建立起的二次线性回归模型准确有效，对试验拟合较好。说明本研究对后期利用微生物治理环境中的碲污染问题具有重要意义。

参考文献：

[1]Fan Y Q，Yang Y X，Xiao Y P，et al. Recovery of tellurium from high tellurium-bearing materials by alkaline pressure leaching process：thermodynamic evaluation and experimental study[J]. Hydrometallurgy，2013，139：95-99.

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[5]郭小伟，郭旭明. 从碱性溶液中发生氢化物的原子荧光/原子吸收光谱法测定Te4+及Te6+[J]. 光谱学与光谱分析，1996，16（3）：88-92.

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