改进的变色酸分光光度法测海南粗榧生物碱总碱含量

王峰 乔飞 江雪飞

摘要：以传统测定海南粗榧生物碱的方法为对照，参照改良的测甲醛含量的方法对其进行优化，以建立安全、快捷、准确测定海南粗榧生物碱总碱含量的新方法。结果表明，新方法兼备以上2种方法的优点，同时又避免了其缺点，具体表现为（1）用磷酸、过氧化氢取代98%浓硫酸，更安全；（2）用微波加热取代水浴加热，更快捷；（3）增加了挥发干甲醇溶剂的试验步骤，排除了甲醇溶剂的干扰，更准确；（4）试验进一步明确了最佳加热时间为35 s，最佳检测波长为558 nm。结果还表明，新方法在0～20 μg/mL范围内，三尖杉碱标准曲线回归方程为y=0.018 4x，线性相关系数r=0.999 5；重复性检测样品的RSD=0.59%；标样回收率98.85%～106.86%，且24 h内显色稳定，测定结果与传统方法无显著差异。综上，新方法安全、快捷、可靠，可作为测定海南粗榧生物碱总碱含量的新方法。

关键词：生物碱；总碱含量；海南粗榧；变色酸分光光度法；测定方法改进

中图分类号： R284.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0146-04

海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis）为三尖杉科三尖杉属孑遗植物，是三尖杉科分布位置最南的树种，主产于我国海南省，为国家二级重点保护植物[1-2]。自20世纪70年代至今，科研人员从海南粗榧的树皮、茎、叶、种子中已分离鉴定出50种生物碱，其中三尖杉碱3位羟基被酰化后的三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱经动物试验和临床实践证实，对各类白血病及急性淋巴病的治疗有明显疗效[3-5]，是目前抗癌最有潜力的自然药源之一。因而，加强对海南粗榧资源的保护和开发利用研究具有重要的理论和现实意义。然而不同产地、不同树龄、不同部位的海南粗榧生物碱的含量差异很大，因而建立准确、快捷、安全的测定海南粗榧生物碱含量的方法，不仅有利于开展海南粗榧生物碱分布、影响生物碱含量的因素等各方面的研究工作，而且有利于对海南粗榧及其同属植物资源开展药用价值的评价工作。

目前分析植物生物碱及其制剂的方法主要有滴定法、分光光度法（酸性染料比色法）、薄层扫描法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、红外光谱法等[6]。其中分光光度法因其投资成本低、操作简便、适用于总碱测定而被广泛应用。海南粗榧生物碱分子中含有亚甲二氧基结构，亚甲二氧基在酸性条件下能水解生成甲醛，甲醛与变色酸反应可生成紫色络合物，因而可以通过变色酸分光光度法测定其含量[7]。目前测定海南粗榧生物碱总碱含量的方法就是参考传统测定甲醛的变色酸分光光度法建立的（以下简称“方法1”）[7]，该方法具有价格便宜、操作简单、反应色泽灵敏和选择性好等优点，但最大的缺点是试验过程中需要使用热浓硫酸氧化与脱水，具有潜在的危险性、腐蚀性，并且需要水浴加热显色，试验耗时长。

近年来，测定甲醛的变色酸分光光度法已经得到改良，如试验过程中的浓硫酸被磷酸取代，水浴加热被微波加热取代等，既增加了试验的安全性，又缩短了试验时间，提高了测定效率[8-12]。至于海南粗榧生物碱总碱含量能否用改良测甲醛的方法（以下简称“方法2”）[13]进行测定，如果能用，试验条件需要哪些优化等问题，都有待试验验证。本研究拟以方法1为对照，优化方法2的试验条件，以期建立一种安全、快捷又准确的测定海南粗榧生物碱含量的方法（以下简称“方法3”）。

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂

主要仪器：紫外分光光度计（Beckman DU800），微波炉，水浴锅。

主要试剂：变色酸（临用前现配成0.1 g/mL溶液），过氧化氢（临用前现配成0.025 moL/L溶液），浓硫酸（98%），磷酸（86%），甲醇（99.9%），三尖杉碱标样（购自上海源叶生物科技有限公司），除三尖杉碱标样、甲醇为色谱纯外，其他试剂均为分析纯。

1.2植物材料

本试验以海南粗榧的嫩枝、叶片为材料，采自中国热带农业科学院海南热带植物园（儋州），将采摘的嫩枝、叶片迅速置于电热鼓风干燥箱中于105 ℃杀青，80 ℃烘干后研磨成细粉备用。

1.3试验设计

首先以三尖杉碱标样为试验材料，参照方法1、方法2制作三尖杉碱标准曲线，根据试验比对结果进一步对方法2的试验试剂、检测波长、加热时间、试验过程等各条件进行逐一优化，综合各优化条件建立方法3。再以三尖杉碱标样、海南粗榧嫩枝、叶片提取的样液为试验材料，对方法3的重复性、标样回收率、有色化合物的稳定性等各方面进行检验，最后以方法1的测定结果为参照，判断方法3的准确性，以期建立一种安全、准确、便捷的测定海南粗榧生物碱总碱含量的新方法。

1.4试验方法

1.4.1三尖杉碱标准溶液的配制方法精确称取10.0 mg三尖杉碱标准品，溶于甲醇并定容至5 mL容量瓶中，配制成浓度为2 mg/mL的母液。再将母液分别稀释成浓度梯度为0、250、500、1 000、2 000 μg/mL的工作液，各1 mL，于4 ℃冰箱保存备用。

1.4.2三尖杉碱标准曲线的制作方法方法1[7]：分别取按“1.4.1”節配制的不同浓度梯度的三尖杉碱标准溶液 100 μL，放入50 mL烧杯中，加现配的500 μL 0.1 g/mL变色酸溶液，再加入3.5 mL 98%浓硫酸，摇匀，于沸水浴中加热20 min，取出后迅速用冷水浴冷却，再加3 mL蒸馏水摇匀，待冷却至室温后，转移至10 mL容量瓶内并加水定容，于 570 nm 处比色，以三尖杉碱浓度为横坐标、D570 nm为纵坐标制作三尖杉碱标准曲线。

方法2[13]：分别取按“1.4.1”节配制的不同浓度梯度的三尖杉碱标准溶液100 μL，放入50 mL烧杯中，加新配制的300 μL 0.1 g/mL变色酸溶液，加入3 mL 86%浓磷酸，70 μL 0.025 mol/L过氧化氢，摇匀，于1 200 W微波炉中加热35 s，取出后室温下冷却，再加蒸馏水3 mL摇匀，待冷却至室温后，转移至10 mL容量瓶内并加水定容，于570 nm处比色，以三尖杉碱浓度为横坐标、D570 nm为纵坐标制作三尖杉碱标准曲线。

1.4.3海南粗榧嫩枝、叶片中生物碱的提取方法[14]分别称取“1.2”节制备的海南粗榧嫩枝、叶片干粉3 g，加2 mL 28%的氨水，加30 mL三氯甲烷后，用磁力搅拌器搅拌均匀，浸泡过夜后于3 000 r/min离心15 min，取三氯甲烷层溶液 10 mL，于通风橱内挥发干三氯甲烷，残渣再用甲醇溶解，定量转移至1 mL小容量瓶中备用。试验设3次重复。海南粗榧生物碱总碱含量以三尖杉碱计[7]。

2结果与分析

2.12种方法制作三尖杉碱标准曲线的比较

用方法1建立的三尖杉碱标准曲线（图1）的相关系数 r=0.998 8，回归方程为y=0.020 5x。用方法2建立的三尖杉碱标准曲线（图2）的相关系数r=0.931 0，回归方程为 y=0.015 3x。通过比较发现，将测甲醛的方法2直接用于测定三尖杉碱时，制作的标准曲线的相关系数有所降低，与方法1的0.998 8相差较大，有待改良。分析可能导致这种结果的原因较多，因此拟从样品前处理溶剂、加热时间、比色波长等逐一进行优化。

2.2样品前处理溶剂的优化

有研究表明，甲醇作为溶剂可参与变色反应[15-16]，那么在制备三尖杉碱标准溶液时所用的甲醇溶剂是否也参与了变色反应，从而干扰了试验结果，导致方法2制作的标准曲线相

关系数较低？为排除这一可能干扰，本研究分别以各100 μL甲醇、乙醇、叔丁醇为样液，用方法2分别测定其吸光度。图3结果表明，3种溶剂确实在570 nm波长下检测时都存在吸收峰，即它们均有可能参与显色反应，从而对测定三尖杉碱含量的结果造成干扰。

为排除溶剂干扰影响试验准确性的问题，本研究拟在正常制备三尖杉标准溶液后，增加1个试验步骤，即对于制备好的三尖杉碱标准溶液首先通过通风挥发干其溶剂甲醇，再继续用方法2制作三尖杉碱标准曲线。由图4可知，挥发干甲醇溶剂后所建的标准曲线的相关系数r由原来的0.931 0提高到0.999 7，经方差分析，两者差异达到显著水平（P<0.05）。

2.3最佳微波加热时间的确定

方法2中的微波加热时间即为有色化合物的显色时间，加热时间过短，显色反应不充分，时间过长，又会出现炭化反应[13]，因而本试验拟对方法3的微波加热时间进行筛选。试验设定微波加热功率为1 200 W，微波加热时间分别设0、10、15、25、30、35、40[JP3]、45、50、55、60 s，共11个处理。取 2 000 μg/mL

三尖杉碱标准溶液100 μL，挥发干甲醇后，用方法2比较不同加热时间测得的D570 nm变化。

图5结果表明，随着加热时间的增加，D570 nm也随之提高，但不同时间段D570 nm提高的幅度并不一致；大致变化趋势表现为在加热0～10 s范围内，D570 nm缓慢提高；在10～30 s范围内，D570 nm快速提高；30 s后D570 nm增幅则逐渐趋于平稳。经Logistic方程拟合发现，加热22 s时，D570 nm达最大值的50%；加热35 s时，D570 nm则已达最大D570 nm的80%；而当加热时间超过40 s后，反应体系出现了炭化反应，即有黑色颗粒物生成，从而导致测得的D570 nm比实际值增大。综上，最终确定测定三尖杉碱时最佳的微波加热时间为35 s。

2.4最佳检测波长的确定

随着反应体系中溶剂的种类、浓度及样品溶液成分的改变，都会导致吸光度变化，最佳检测波长也会随之发生变化[8]。本试验拟对方法3的最佳检测波长进行筛选，吸取100 μL 2 000 μg/mL三尖杉碱标准溶液，通风挥发干甲醇后，用方法2在400～800 nm波长范围内连续扫描测定有色化合物的吸光度。结果表明：在400～558 nm范围内，随着检测波长增大，测得的吸光度也随之增加；当波长超过558 nm后，随着波长的增大，吸光度反而减小，即方法3反应获得的有色化合物在波长558 nm处有最大吸收峰（图6）。

2.5方法3的确定

取适量供试样品溶液，放入50 mL烧杯中，挥发干样品溶液中的甲醇溶剂后，加新配制的300 μL 0.1 g/mL变色酸溶液，再加入3 mL 86%浓磷酸、70 μL 0.025 mol/L过氧化氢，摇匀，于1 200 W微波炉中加热35 s，取出后加3 mL蒸馏水摇匀，室温下冷却，最后转移至10 mL容量瓶加水定容，于558 nm处比色。其中三尖杉碱的检测线性范围为0～20 μg/mL。

2.6方法3的检验

2.6.1方法3制作三尖杉碱标准曲线的检验由方法3制作的三尖杉碱标准曲线（图7）的回归方程为y=0.018 4x，相关系数r=0.999 5，达到显著水平（P<0.05）。说明在0～20 μg/mL 浓度范围内，三尖杉碱的浓度与方法3测得的吸光度呈良好的线性关系，可以通过该比色方法测定样品中三尖杉碱含量。

2.6.2方法3的重复性检验用方法3对2 000 μg/mL三尖杉碱标准溶液进行6次重复测定。由表1可见，6次重复测定的D570 nm变化范围为0.423 7～0.433 6，平均D2.6.3方法3的标样回收率检验用方法3分别测定已知含碱量的样液及添加标样后的样液，通过计算标样回收率检验方法3的准确性，试验设3次重复。具体试验步驟：取已知含碱量的海南粗榧嫩枝和叶片样品溶液各20 μL，分别添加 25 μL 1 000 μg/mL三尖杉碱标准溶液，用方法3测定其D570 nm并计算标样回收率。结果表明，方法3测得的海南粗榧嫩枝、叶片样品中的标样平均回收率分别为106.86%、98.85%，RSD分别为3.31%、4.78%，说明方法3的系统误差较小，符合试验要求。

2.6.4方法3的有色化合物稳定性检验将方法3反应获得的有色化合物放置不同时间后再比色测定吸光度，检验方法3反应获得有色化合物的稳定性。本试验分别以 2 000 μg/mL 三尖杉碱标准溶液、海南粗榧嫩枝、叶片提取液为试样，用方法3反应生成有色化合物，分别在常温下放置1、2、4、6、8、12、24 h后测定其吸光度D570 nm，试验设3次重复。由表2可知，3种样品反应的有色化合物在放置不同时间后测得的D570 nm的RSD分别为1.61%、1.23%、1.28%，反应络合物基本稳定。说明用方法3测定三尖杉碱时获得的有色化合物在24 h内稳定性很好。

2.6.5方法3与方法1测定结果的比较以海南粗榧的嫩枝、叶片提取液为试验材料，分别用方法1、方法3测定其生物碱总碱含量。由图8可见，用方法1测得的嫩枝、叶片的生物碱含量分别为0.281 1%、0.350 3%，用方法3测得的嫩枝、叶片的生物碱含量分别为0.242 4%、0.267 4%，由此可知，方法3测得的D570 nm均比方法1的低，但经方差分析，2种方法测的结果差异并不显著，说明方法3、方法1均可用于测定海南粗榧生物碱总碱含量。

[TP王峰8.tif]

3讨论与结论

三尖杉生物碱仅存于三尖杉科植物中，由Wall等于1954年首次发现[17]，我国于20世纪70年代起开展相关研究，并利用浓硫酸处理检测甲醛方法对国内不同种三尖杉植物中的三尖杉总碱含量进行了系统检测，结果表明：三尖杉生物碱总碱含量在0.1%～0.4%范围内[18]，这与本试验用磷酸处理的变色反应检测结果一致。三尖杉生物碱总碱的含量随着产地、植株年龄等变化，并且随着诱导方法的不同有变化[19]。快速鉴定三尖杉生物碱的含量对于评估收获时期、诱导效果有重要意义。

Eegriwe于1937年建立了用變色酸光度法测定甲醛含量的方法[20]，该方法被不断优化并广泛应用于食品、化工、环境中甲醛含量的测定[21-22]，并且该方法还进一步被用于其他结构中含有亚甲二氧基化合物的测定[23]。由于海南粗榧生物碱总碱均含有亚甲二氧基结构，本研究参考优化测定甲醛的方法，建立了测定海南粗榧生物碱总碱的方法，该方法准确、快捷、安全，并且与传统方法相比可取得一致的结果。

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