南方红豆杉枝叶中10—DABⅢ与紫杉醇HPLC检测及检测样的制备

查冲+杜亚填+刘磊磊+刘建兰+宋科

摘要：采用单因素、多因素正交试验研究南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DABⅢ）、紫衫醇的高效液相色谱（HPLC）检测方法及检测样制备。结果显示，检测样制备采用10倍量甲醇于40 ℃恒温水浴条件下浸提3 h，即可使 10-DABⅢ、紫杉醇得率达到峰值，且提取时间不宜超过3 h，否则会导致检出结果比实际含量偏低。由于采用 10-DABⅢ、紫杉醇混合同时检测，结果发现选择适当的流动相梯度洗脱方案较为关键，較好的洗脱方案会使检测图谱的基线分离较好。

关键词：10-DABⅢ；紫杉醇；南方红豆杉；高效液相色谱（HPLC）检测；检测样

中图分类号： R284.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0140-06

南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）是红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）在中国的1个变种，是国家一级保护树种。红豆杉植物中的紫杉醇属于二萜类化合物，是目前最有效的抗癌药物，主要用于治疗卵巢癌、乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也有一定的疗效[1-2]。红豆杉植物生物合成紫杉醇的最重要前体物质 10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DABⅢ），也是二萜类紫杉烷衍生物，是目前半合成生产紫杉醇或多烯紫杉醇（多烯它赛，docetaxe）的主要原料，故10-DABⅢ常与紫杉醇一起被研究[3]。紫杉醇、10-DABⅢ在红豆杉植物体中含量极低（一般 <0.03%），基本不具备商业提取价值，且天然资源非常有限。因此，提高红豆杉枝叶中紫杉醇或10-DABⅢ的含量，是解决紫杉醇药源问题的途径之一。通过选育，发现在一种欧洲红豆杉枝叶中10-DABⅢ的含量高达0.11%，故该红豆杉的枝叶是目前市场上提取生产10-DABⅢ的主要原料[4]。但在21世纪初，国内为解决紫杉醇药源短缺问题，曾大量种植南方红豆杉，现因其药用成分含量低（紫衫醇含量约≤001%）而被闲置[5]。本研究团队通过研究南方红豆杉根际微生物发现，可通过微生物作用来大幅提高南方红豆杉枝叶中紫杉醇、10-DABⅢ含量[6-8]。为了能较快捷、精准地开展该研究，本试验对南方红豆杉枝叶中10-DABⅢ和紫杉醇的分析检测方法进行了较为系统的研究与优化，以为进一步的相关研究提供基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

南方红豆杉枝叶（该南方红豆杉种植在湖南省岳阳市平江县黄金洞乡金星村，树龄为6年，湖南东慧红豆杉科技开发有限公司）。紫杉醇对照品[高效液相色谱（HPLC）检测用对照品，≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司]，10-DABⅢ对照品（HPLC检测用对照品，≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甲醇（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司），二氯甲烷（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司），乙醇（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司），乙酸乙酯（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），丙酮（分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司），95%乙醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），乙腈（HPLC级，美国TEDIA试剂有限公司），甲醇（HPLC级，美国TEDIA试剂有限公司），蒸馏水（自制）等。

LC-1260高效液相色谱仪，1260无限二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）。紫杉醇检测专用色谱柱（MetaChem Taxsil，250 mm×4.6 mm，5 μm，美国迪马公司）。万分之一天平（ML-204，瑞士梅特勒-托利多公司），十万分之一天平（AEG-220，日本岛津公司），植物粉粹机（FY-130，天津市能斯特仪器有限公司），旋转蒸发仪（R-215，德国海道夫公司），数显鼓风干燥器（GZX-9146MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂），数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司），超声波清洗器（KQ-250E，昆山市超声仪器有限公司），紫外可见分光光度计（U-3900，日本日立公司）。

1.2检测样的制备

采集南方红豆杉枝叶，50 ℃烘箱烘干，粉碎过筛，精确称取3 g枝叶粉末，放入50 mL锥形瓶中，加入甲醇30 mL，40 ℃ 恒温水浴条件下浸提6 h，取出超声辅助提取30 min；取上清液，残渣复加30 mL甲醇，超声辅助提取30 min，合并2次上清液，过滤，滤液于40 ℃条件下减压浓缩，浸膏以 15 mL 二氯甲烷 ∶[KG-*3]15 mL水进行萃取，超声处理 5 min 后转入离心管中，4 000 r/min离心5 min；收集二氯甲烷相，水相复加 15 mL 二氯甲烷，进行萃取，重复上一步骤，合并2次二氯甲烷相，40 ℃减压浓缩，用少量色谱甲醇充分洗出浓缩固形物于10 mL容量瓶中，并用色谱甲醇定容至 10 mL，用0.45 μm微孔膜过滤至Tube管中，置于冰箱中冷藏，备HPLC检测用。

1.3采用不同溶剂提取制备检测样

准确称取南方红豆杉干枝叶粉末3 g，共4份，分别以95%乙醇、甲醇、甲醇+二氯甲烷（体积比1 ∶[KG-*3]1）混合液，乙酸乙酯+丙酮（体积比1 ∶[KG-*3]1）混合液为浸提溶剂，10倍量水浴恒温40 ℃提取，浸提6 h后按“1.2”节方法制备供试样品以备检测用。

1.4采用不同温度提取制备检测样

准确称取南方红豆杉干枝叶粉末3 g，共4份，于水浴中分别采用10、25、40、55 ℃温度提取，以甲醇为浸提溶剂，10倍量溶剂提取6 h后按“1.2”节方法制备供试样品。

1.5采用不同时间提取制备检测样

准确称取南方红豆杉干枝叶粉末3 g，共5份，分别置于5个提取容器中并各自加入10倍量甲醇，于40 ℃水浴中，分别提取1、2、3、4、5 h后按“1.2”节方法制备供试样品。

1.6采用不同料液比提取制备检测样

准确称取南方红豆杉干枝叶粉末3 g，共5份，以甲醇为提取溶剂，分别采用1 g ∶[KG-*3]5 mL、1 g ∶[KG-*3]10 mL、1 g ∶[KG-*3]15 mL、1 g ∶[KG-*3]20 mL、1 g ∶[KG-*3]25 mL的料液比，于40 ℃水浴恒温条件下分别提取3 h后按“1.2”节方法制备供试样品。

1.7多因素正交试验提取制备检测样

根据上述单因素试验结果，进一步选择浸提温度、时间、料液比3个因素，以紫杉醇、10-DABⅢ制得率为观察指标，采用L9（34）正交设计（表1）进行试验。每组均准确称取南方红豆杉干枝叶粉末3 g，以无水甲醇为提取溶剂，提取后按 “1.2” 节方法完成检测样的制备。

1.810-DABⅢ与紫杉醇最适测定波长的确定

选取最佳的检测波长可以保证紫杉醇、10-DABⅢ达到最大的紫外吸收和最小的干扰，提高检测的灵敏性、准确度。采用紫外可见分光光度计对紫杉醇、10-DABⅢ对照品标准溶液分别进行紫外光谱扫描，发现2种物质均在 230 nm 处有较高吸光度（图1），故选择230 nm为检测波长。

1.9HPLC检测条件

色谱柱为MetaChem Taxsil（250 mm×4.6 mm，5 μm），进样量为20 μL，流速1 mL/min，检测波长为230 nm，柱温 30 ℃，采用1260无限二极管阵列检测器。

1.10流动相

流动相采用乙腈/水梯度洗脱法。方案1（参照朱慧芳的[JP3]HPLC方法[9]改進）：梯度洗脱时间设计为0～6 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（20 ∶[KG-*3]80）～（40 ∶[KG-*3]60）；6～10 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（40 ∶[KG-*3]60）～（50 ∶[KG-*3]50）；10～21 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=50 ∶[KG-*3]50；21～28 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（100 ∶[KG-*3]0）；28～30 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=20 ∶[KG-*3]80。方案2：梯度洗脱时间设计为0～6 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=20 ∶[KG-*3]80；6～15 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（20 ∶[KG-*3]80）～（40 ∶[KG-*3]60）；15～30 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（40 ∶[KG-*3]60）～（50 ∶[KG-*3]50）；30～37 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（50 ∶[KG-*3]50）～（100 ∶[KG-*3]0）；37～40 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（100 ∶[KG-*3]0）～（10 ∶[KG-*3]90）。方案3：0～6 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=20 ∶[KG-*3]80；6～15 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（20 ∶[KG-*3]80）～（40 ∶[KG-*3]60）；15～25 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（40 ∶[KG-*3]60）～（70 ∶[KG-*3]30）；25～30 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（70 ∶[KG-*3]30）～（50 ∶[KG-*3]50）；30～32 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（50 ∶[KG-*3]50）～（90 ∶[KG-*3]10）；32～37 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（90 ∶[KG-*3]10）～（100 ∶[KG-*3]0）；37～40 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（100 ∶[KG-*3]0）～（10 ∶[KG-*3]90）。

1.11标准曲线的绘制

准确称取紫杉醇对照品2.60 mg、10-DABⅢ对照品 1.90 mg 于25 mL容量瓶中，用色谱级甲醇溶解并定容配制成混合对照品标准液。分别精确吸取混合对照品标准液1、2、4、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇定容至 10 mL，经0.45 μm微孔膜过滤、脱气处理后，按“1.9”节的色谱条件、“1.10”节试验得出的最佳梯度洗脱方案，分别进行进样检测，并以浓度y（μg/mL）对峰面积x进行最小二乘法线性回归，绘制标准曲线。10-DABⅢ、紫杉醇的浓度分别用y1、y2表示，对应的峰面积分别用x1、x2表示，得回归方程分别为y1=0.048 4x1-1.598 3（r=0.998 9，n=5），y2=0.041 4x2-2.907 6（r=0.999 2，n=5），10-DABⅢ、紫杉醇分别在7.60～76.00 μg/mL、10.40～104.00 μg/mL范围内的实际浓度与其HPLC检测峰面积间具有良好的线性关系（图2）。

1.12精密度及重复性试验

用“1.2”节制备的样品溶液连续进样5次，采用“1.9”节色谱条件及“1.10”节试验得出的最佳梯度洗脱方案，进行检测，[JP3]根据 “1.11” 节中10-DABⅢ与紫衫醇的出峰保留时间，分别计算每1次各自的峰面积，并对结果进行方差分析与检验。

1.13稳定性试验

选择“1.11”节中配制的任意浓度的10-DABⅢ、紫衫醇对照品标准液，按“1.9”节色谱条件及“1.10”节试验得出的最佳梯度洗脱方案，每间隔2 h进样1次，重复进样6次，然后根据测得的10-DABⅢ、紫衫醇的峰面积进行统计分析与检验。

1.14加样回收试验

准确称取南方红豆杉枝叶粉末5份，每份2 g，分别置于100 mL三角瓶中，编号1、2、3、4、5，并分别加入适量对照品（表2），之后按“1.2”节的方法制备样品检测液，按“1.9”节的色谱条件、“1.10”节的最佳流动相梯度洗脱方案进行检测。

[HS2][JZ]加样回收率=[SX（]加标样品检出量-样品检出量加入对照品量[SX）]×100%。

2结果与分析

2.1梯度洗脱方法的影响

根据HPLC检测图谱（图3），不同的梯度洗脱方案，样品

中被检测成分的洗脱分离效果不同。由图3可以看出，梯度洗脱方案3的效果优于方案1、2。采用方案3，对照品中紫杉醇在30 min内出峰，10-DABⅢ在20 min内出峰，且基线分离较好（图3-e、图3-f）。方案1的图谱（图3-a、图3-b）显示，10-DABⅢ 的类似物较多，分离得不够好。方案2的对照品中紫杉醇的出峰出现前延与基线漂移现象（图3-c、图3-d），样品中 10-DABⅢ 的类似物较多，分离不够好。

2.2精密度及重复性

5次重复进样检测结果（表3）显示，10-DABⅢ、紫杉醇峰面积值的RSD分别为3.11%、1.16%（n=5），均符合精密度要求，重复性较好。

2.3稳定性

连续6次间隔2 h进样检测结果显示，10-DABⅢ、紫杉醇峰面积的RSD分别为2.11%、3.71%（n=6）（表4），说明仪器和供试品在12 h内的稳定性均较好。

之间相差不太明显，据HPLC图谱观察，提取物中杂质含量均看不出差别。考虑到检测成本与安全性，选择甲醇为提取溶剂较好。

2.6提取温度对样品制备的影响

由图5可以看出，温度对提取物中2种紫杉烷类化合物得率的影响较明显，在40 ℃条件下，10-DABⅢ、紫杉醇的得率较高，故选择40 ℃为样品制备的提取温度。

2.7提取时间对样品制备的影响

由图6可以看出，提取时间为3 h时，10-DABⅢ、紫杉醇的得率已达到极大值，之后紫杉醇得率出现较明显降低，说明检测样制备的提取时间以3 h为宜，不宜过长，紫杉醇可能会因提取时间过长而分解，影响检测结果与实际含量间的误差。

2.8料液比对样品制备的影响

由图7可以看出，当甲醇加入量料液比为1 g ∶[KG-*3]10 mL时，提取物中紫杉醇、10-DABⅢ的得率已达峰值或较大值，再增加溶剂量，二者得率不再有明显变化，说明加入10倍量甲醇所得的提取物，已能较好地显示材料中目标物的真实含量。

2.9正交试验

据正交试验结果分析和方差SS值判断，SSB>SSA>SSC，即浸提时间是检测样制备提取过程中的重要影响因素，浸提温度为次要因素，料液比影响最小（表7～表10）。据均值k分析，10-DABⅢ 以A2B2（或B3）C3为最优，B2与B3的得率相差甚微，紫杉醇以A2B2C3为最优。综合单因素试验结果，选择A2B2C3为最优化方案，即以甲醇提取溶剂，浸提温度为 40 ℃、时间为3 h、料液比为1 g ∶[KG-*3]15 mL即可。

3结论与讨论

红豆杉植物中10-DABⅢ、紫杉醇含量HPLC检测方法相关的研究较多[10-13]，但发表的文章中相关检测图谱的基线均分离不够好。本试验对检测样制备到检测条件优化进行了较系统的研究，并针对样品制备中的提取环节进行正交试验。结果发现，浸提温度为40 ℃、时间为3 h、料液比为 1 g ∶[KG-*3]15 mL 时，能较好地满足检测样制备提取要求，使 10-DABⅢ、紫杉醇的得率均可达到峰值，且提取时间不宜超过 3 h，否则已提取出来的紫杉醇会因时间过长而降解，影响检测结果的真实性。有报道用不同流动相梯度洗脱方法对血液[14]、愈伤组织[15]、注射针剂[16]中的紫杉醇进行HPLC检测分析，可见梯度洗脱对分离复杂样品具有分离时间短、精密度高等優点，与等度洗脱方法相比，它能改善分离效果。本试验还发现梯度洗脱方案的优化对检测结果的影响较大，会影响检测图谱的基线分离。所以，本研究结果对生产紫杉醇、10-DABⅢ均具有应用参考意义。检测样制备过程中如何减少或除去背景成分中的类似物，仍值得进一步研究。

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