高效液相色谱法测定脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量Δ

李 婷，安红丽，辛 蕾，封卫毅，张玉平

(1.西安交通大学第一附属医院药学部，陕西 西安 710061； 2.西安交通大学第一附属医院医学转化中心，陕西 西安 710061)

高效液相色谱法测定脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量Δ

李 婷1*，安红丽2，辛 蕾1#，封卫毅1，张玉平1

(1.西安交通大学第一附属医院药学部，陕西 西安 710061； 2.西安交通大学第一附属医院医学转化中心，陕西 西安 710061)

目的：建立高效液相色谱法测定脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量。方法：色谱柱为Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为0.03%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为1 ml/min；柱温为30 ℃；检测波长为278 nm；单次自动进样体积为5 μl。结果：哈巴俄苷质量浓度在5.0～500.0 μg/ml(即0.025～2.500 mg)范围内与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.999 7)，平均回收率为98.11%(RSD=1.32%，n=5)。结论：本方法为脉络宁注射液质量标准的制定提供了新的依据，为临床安全用药提供了理论指导。

脉络宁注射液； 哈巴俄苷； 含量测定； 高效液相色谱法

脉络宁注射液是由玄参、牛膝、石斛、金银花等中药材制成，具有活血化瘀、清热养阴的功能，可用于静脉血栓形成、血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及其后遗症等的治疗[1]。临床上许多报道指出，应用脉络宁注射液会产生不良反应，其中，过敏反应是其突出的不良反应。根据初步研究结果，确定哈巴俄苷是脉络宁注射液中潜在致敏组分，故本研究参考相关文献[2-11]，采用高效液相色谱(high performance liquid chromat-ography，HPLC)法对脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量进行测定。

1 材料

1.1 仪器

RPL-10ZD型装柱机(大连日普利科技仪器有限公司)；HC-3018R型高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；QL-901VORTEX型涡旋混匀仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；SB-5200型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；ZNCL磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；RG-18型高效液相色谱/质谱联用仪(日本岛津公司)；SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；MCO-15AC型CO2细胞培养箱(日本三洋电机株式会社)；XDS-1B型倒置显微镜(上海光学仪器厂)；TDL80-2b型台式电动离心机(上海安亭科学仪器厂)；YXQ-LS-50SⅡ型高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；滤器(培养基专用，上海艾研生物科技有限公司)；优普超纯水机(成都超纯科技有限公司)；101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)；AUY-120型精密天平(日本岛津公司)；YP-5102型电子天平(上海光正医疗仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

哈巴俄苷(纯度≥98%，成都普菲德生物技术有限公司，批号：130604)；脉络宁注射液(批号：20120206、20131005、20131113、20140426、20140907)；磷酸(西安化学试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为0.03%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈，流速设定为1 ml/min，哈巴俄苷的检测波长为278 nm，单次自动进样5 μl，色谱柱柱温设定为30 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 哈巴俄苷系列质量浓度对照品溶液的制备：精密称取哈巴俄苷对照品5 mg分别置于6个5 ml棕色容量瓶中，加入色谱纯甲醇超声溶解，混匀，并最终用色谱纯甲醇定容，得到6份质量浓度均为1 mg/ml的哈巴俄苷储液，用甲醇分别将各自的储液稀释至哈巴俄苷终质量浓度为5.0、10.0、50.0、100.0、300.0、500.0 μg/ml的系列质量浓度样品，置于4 ℃条件下避光保存，用于哈巴俄苷的线性关系考察。

2.2.2 脉络宁注射液供试品溶液的制备：精密量取脉络宁注射液1 ml置于10 ml容量瓶中，用抽滤过的超纯水定容至刻度，混匀，用0.22 μm水相微孔滤膜滤过，置于4 ℃条件下避光保存备用。

2.3 方法学验证

2.3.1 哈巴俄苷标准曲线的制备及线性范围考察：将“2.2.1”中制备的哈巴俄苷质量浓度为5.0、10.0、50.0、100.0、300.0、500.0 μg/ml的系列质量浓度对照品溶液分别进入HPLC系统进行色谱分析，重复进样3次，记录色谱图(见图1)，得到各对照品溶液哈巴俄苷的色谱峰面积均值分别为54 009、102 432、548 635、1 148 784、3 240 172、5 525 073，以各样品哈巴俄苷的色谱峰面积为纵坐标(Y)，以各样品中哈巴俄苷的质量浓度为横坐标(X)，进行线性拟合，得到其回归方程为Y=10 993X+1 778，r2=0.999 7。结果表明，哈巴俄苷质量浓度在5.0～500.0 μg/ml(即0.025～2.500 mg)范围内与峰面积呈良好的线性关系。

A.供试品；B.对照品A.test samples；B.reference substance图1 系统适用性实验色谱图Fig 1 Chromatograms of system suitability test

2.3.2 检测限与定量限：采用目测法计算信噪比(S/N)，当S/N=3时，所分析哈巴俄苷的质量为检测限；当S/N=10时，所分析哈巴俄苷的质量为定量限。测得该方法下哈巴俄苷的检测限为0.75 ng，定量限为2.50 ng。

2.3.3 日内与日间精密度：24 h内，分别连续5次重复分析低、中、高3个质量浓度(20.0、200.0、400.0 μg/ml)的哈巴俄苷对照品溶液，得到色谱图中哈巴俄苷峰的色谱峰面积(见表1)，计算低、中、高2个质量浓度对照品溶液中哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.25%、0.79%、0.27%，说明该色谱条件下哈巴俄苷测定方法的日内精密度良好。连续5 d，每日分别进样低、中、高3个质量浓度的哈巴俄苷对照品溶液各3次，记录各自的峰面积，取5 d内每日进样低、中、高3个质量浓度的色谱图中哈巴俄苷色谱峰面积的平均值(见表2)，计算低、中、高3个质量浓度峰面积的RSD分别为1.46%、1.98%、1.11%，说明该色谱条件下哈巴俄苷测定方法的日间精密度良好。

表1 哈巴俄苷的日内精密度

表2 哈巴俄苷的日间精密度Tab 2 Intra-day precision of harpagoside

2.3.4 稳定性实验结果：将脉络宁注射液与400.0 μg/ml的哈巴俄苷对照品溶液置于室温(25 ℃)条件下，分别于0、6、12、24、48 h进样分析，记录每次进样色谱图中哈巴俄苷的色谱峰面积(见表3)，计算0、6、12、24、48 h峰面积与0 h峰面积的比值(Ar/A0)，其值在98%～102%之间，符合稳定性考察要求，故脉络宁注射液与哈巴俄苷对照品溶液在室温(25 ℃)条件下48 h内稳定。

表3 稳定性实验结果Tab 3 Stability of the experimental results

2.3.5 加样回收率实验结果：将脉络宁注射液供试品溶液连续进样，每次进样5 μl，记录进样色谱图中哈巴俄苷的色谱峰面积，通过标准曲线方程计算出脉络宁注射液中哈巴俄苷的质量，向脉络宁注射液分别加入质量浓度为0.50 mg/ml的哈巴俄苷溶液80、80、80、100、100、100、120、120、120 μl进样分析，记录每次进样后色谱图中哈巴俄苷的色谱峰面积，通过标准曲线方程计算出加样后脉络宁注射液中哈巴俄苷的质量，根据公式计算加样回收率，结果见表4。低、中、高三组加入哈巴俄苷的脉络宁注射液的加样回收率分别为(98.02±0.41)%、(96.69±0.24)%、(99.63±0.22)%，三组的平均回收率为98.11%，三组回收率之间的RSD为1.32%。

2.4 脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量测定结果

在上述色谱条件下，将5批脉络宁注射液分别进样分析，各进样3次，将得到的各色谱图中哈巴俄苷峰色谱峰面积的平均值带入标准曲线方程，计算各供试品中哈巴俄苷的含量，结果见表5。

表4 哈巴俄苷在脉络宁注射液中加样回收率的实验结果Tab 4 Recovery test of harpagoside in mailuoning injections

表5 脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量测定结果Tab 5 Content determination of harpagoside in mailuoning injections

3 讨论

本研究结果显示，所测定的脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量范围为0.87～1.03 mg/ml，说明同一厂家不同批号脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量有差异，这可能与生产工艺、贮藏时间、贮藏条件等有关系。此结果可为进一步的细胞水平、动物水平相关的过敏实验研究提供依据。

任何含量测定方法的建立都需要进行方法学验证，实验结果表明，本研究所建立的哈巴俄苷测定方法，待测样品中哈巴俄苷的含量在5.0～500.0 μg/ml(即0.025～2.500 mg)范围内线性关系良好，该方法对于哈巴俄苷的检测限为0.75 ng、定量限为2.50 ng，日内及日间精密度、稳定性均良好，加样回收率也能够满足哈巴俄苷定量测定试验的要求。因此，本研究所建立的脉络宁注射液中哈巴俄苷的含量测定方法是可行的，可以应用此方法对脉络宁注射液中的哈巴俄苷的含量进行测定，为脉络宁注射液质量标准的制定提供了新的依据，为临床安全用药提供了理论指导。

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Content Determination of Harpagoside in Mailuoning Injections by HPLCΔ

LI Ting1, AN Hongli2, XIN Lei1, FENG Weiyi1， ZHANG Yuping1

(1.Dept.of Pharmacy, the First Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University,Shaanxi Xi’an 710061, China； 2.Medical Transformation Center， the First Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University， Shaanxi Xi’an 710061， China)

OBJECTIVE：To establish the method for content determination of harpagoside in mailuoning injections by HPLC.METHODS: The chromatographic column was Diamonsil C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase A was 0.03% phosphoric acid solution, and mobile phase B was acetonitrile, with flow rate of 1 ml/min, column temperature of 30 ℃, detection wavelength of 278 nm, and single automatic sample volume of 5 μl. RESULTS: The harpagoside showed a good linear relationship in content of 5.0 μg/ml-500.0 μg/ml (0.025 mg-2.500 mg) (r2=0.999 7), the average recovery was 98.11% (RSD=1.32%,n=5). CONCLUSIONS: This method provides new reference for the formulation of quality standard of mailuoning injections, in addition of theoretical guidance for clinical safety administration.

Mailuoning injections; Harpagoside; Content determination; HPLC

陕西省自然科学基金资助项目(No.2016JM8037)

R927.2

A

1672-2124(2017)05-0584-03

2017-03-20)

*药师。研究方向：临床药学。E-mail：121152808@qq.com

#通信作者：药师。研究方向：临床药学。E-mail：396526973@qq.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.05.003