喷射蒸煮结合超滤制备火麻蛋白及其功能特性表征

吴俊锋 杨晓泉 朱元庄

(华南理工大学轻工与食品学院；淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心1，广州 510640)(晋城市汉宝生物科技有限公司2，晋城 048300)

喷射蒸煮结合超滤制备火麻蛋白及其功能特性表征

吴俊锋1杨晓泉1朱元庄2

(华南理工大学轻工与食品学院；淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心1，广州 510640)(晋城市汉宝生物科技有限公司2，晋城 048300)

探索了胶体磨等因素对火麻蛋白提取的影响，并确定了最佳工艺，进而利用喷射蒸煮结合超滤技术从变性火麻粕中制备了火麻蛋白，并对其理化及功能性质进行表征。膜法火麻蛋白(membrane hemp protein，MHP)与传统酸沉法火麻蛋白(traditional acid precipitation hemp protein，THP)蛋白质量分数分别为83.21%与92.24%；其提取率分别为45.37%与40.23%，显著高于未经研磨及热处理所得提取率(16.11%)。电泳表明MHP组成更丰富，且具健康功能。与THP相比，MHP的溶解性、持水性及起泡能力均较好，而泡沫稳定性较差。在pH 2.0及pH 10.0时，2种蛋白的乳化稳定性均优于其他条件下所表现的性质，且MHP具有较好乳化活性。可见喷射蒸煮结合超滤能显著提高火麻蛋白的提取率，且制备的蛋白表现出良好性质。

变性火麻粕 火麻蛋白 喷射蒸煮 超滤技术 理化功能性质

火麻(CannabissativaL.)通过高温压榨产生的火麻油具有较好的营养性，从而产生了大量的副产物——脱壳的变性火麻粕(denatured defatted hemp meal, DDHM)；该副产物富含蛋白，而蛋白变性后较难用传方法来提取其中的蛋白。

喷射蒸煮(jet-cooking)技术是集高温高压、高剪切力于一体的水热处理技术，可以显著提高蛋白的溶出率。Xia等[1]研究表明，该技术能有效地从热稳定米糠中制备良好功能性的米糠蛋白，Yang等[2]通过该技术从难溶性大豆浓缩蛋白中制备了可溶性大豆蛋白。膜超滤技术具有分离及浓缩的作用，可以去除一定小分子物质。

本试验研究了胶体磨等因素对火麻蛋白提取率的影响，确定了最佳的工艺。以最佳工艺下的膜超滤法与传统酸沉法制备了两种蛋白，分别称为膜法火麻蛋白与传统酸沉法火麻蛋白，对其理化功能性质进行了探讨。本研究利用喷射蒸煮结合膜技术从变性火麻粕中制备火麻蛋白，有效提高了蛋白提取率。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

脱壳的变性火麻粕及未脱壳变性火麻粕(denatured defatted hemp meal with skull, DDHMS)与脱壳非变性火麻粕(undenatured defatted hemp meal, UDHM)：晋城市汉宝生物科技有限公司；大豆油：市售；其他试剂均为分析纯。

TA Q100差示扫描量热仪：美国Newcastle公司；Dispax reactor立式胶体磨：德国IKA公司；BQ50S膜设备：保定雷弗流体科技有限公司；HIPS15聚砜膜：德国贝朗公司；喷射蒸煮系统：广州南联食品机械有限公司；Waters 2695高效液相色谱仪：美国Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DSC表征

依Meng等[3]方法测定火麻粕的变性程度。取4.0 mg UDHM和DDHM于铝盘中，加入10 μL磷酸缓冲液(10 mmol/L, pH 7.0)后密封，以6 ℃/min从20 ℃加热至120 ℃,空铝盘作为对照。原料的变性起始温度(T0)、热变性温度(Td)、吸收峰焓变(ΔH)及吸收峰半峰宽度(ΔT1/2)通过Universal Analysis 2000得出。

1.2.2 蛋白制备

按1∶10的料液比在脱壳变性粕中加入去离子水，用2 mol/L NaOH调节pH至9.0。室温搅拌30 min，然后转至胶体磨(6 000 r/min, 10 min)进行研磨，之后回调pH至9.0，室温下再次搅拌20 min。接着转至喷射蒸煮系统(130 ℃, 90 s)进行热处理，待冷却后离心(8 000 r/min, 20 min, 25 ℃)，弃沉淀，收集上清液。

MHP制备：上清液进行循环超滤，泵流速900 mL/min，聚砜膜截留分子质量80 ku。等上清液体积至一半时，加入等量去离子水，此为1次循环，超滤直至透过液无色为止。至上清液浓缩至一定浓度之后，冻干即可。

THP制备：依Tang等[4]方法，有所改动。用2 mol/L HCl将上清液pH调至5.0，离心(8 000 r/min, 20 min,25 ℃)后收集沉淀。沉淀以1∶8的量加入去离子水，用2 mol/L NaOH调pH至7.5，搅拌使其溶解，冻干即可。

用AOAC方法[5]测定变性火麻粕、MHP及THP化学组成。蛋白得率/%=Mp/M0×100，蛋白提取率/%=(Cp× Mp)/(C0× M0) ×100，其中Cp，C0分别为火麻蛋白和火麻粕的蛋白纯度/%，Mp，M0分别为火麻蛋白和火麻粕的质量/g。

1.2.3 SDS-PAGE

取适量样品溶于Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，β-巯基乙醇作为还原剂。沸水煮5 min后离心(5 000 r/min, 5 min)，取5 μL上清液与蛋白标品作为上样液。采用不连续系统进行电泳，上样液在浓缩胶时电流为20 mA，进入分离胶后为40 mA。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色，脱色液为甲醇-乙酸水溶液(甲醇∶乙酸∶水=220∶44∶236，V/V/V)。

1.2.4 溶解度测定

样品溶于水中，形成1%的蛋白溶液，调至不同pH。于室温下充分溶解后，8 000 r/min离心20 min,然后采用Lorry法测定上清液的蛋白含量，以牛血清蛋白作标准蛋白制作标准曲线。溶解度=上清液蛋白含量/样品蛋白含量×100%。

1.2.5 持水性

1.0 g样品置于25 mL预称重的离心管(m0)中，加入15 mL不同pH的水中，搅拌20 min。然后8 000 r/min离心20 min，弃上清液，称量离心管质量为m1。持水性=(m1-m0-1.0)/1.0。

1.2.6 乳化性与起泡性

不同pH 1%的样品溶液18 mL与6 mL大豆油在10 000 r/min的均质机中搅打1 min，在0与10 min时均从底部取100 μL乳液，然后分别与5 mL 0.1% SDS溶液漩涡5 s，马上于500 nm测定吸光值A0与A10。

乳化活性=(2×2.303×A0×DF)/c×Φ×(1-θ), 乳化稳定性/min=(A0×10)/(A0-A10)，其中DF为稀释因子(50)，c是样品初始质量浓度/g/mL，Φ是光程(1 cm)，θ是乳液中油的比率。

不同pH 的1%样品溶液20 mL在10 000 r/min的均质机中搅打2 min，马上转移至50 mL量筒中，分别记录0与30 min的体积V1与V2/mL。气泡能力=(V1-V0)/V0, 气泡稳定性=(V2-V0)/V0，其中V0为均质前体积。

1.3 数据分析

每次试验重复3次，结果以平均值±标准偏差(Means±SD)来表示。利用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析和OriginPro 8.0软件进行作图，置信度为95%的最小显著性差异来比较平均值。

2 结果与讨论

2.1 原料与产品的基本表征

2.1.1 化学组成与提取率

由表1可知，DDHMS由于未脱壳，因而其蛋白质量分数较低，而纤维含量较高；UDHM的蛋白质量分数较高，纤维含量较低，因为其是经脱壳后进行提油处理而得到的非变性粕。DDHM的蛋白质量分数达63.69%，显著高于Malomo等[6](44.32%)及Tang等[4](50.20%)的报道，这可能与火麻种类有关。此外火麻粕主要还由纤维(13.52%)和水分(9.24%)组成。MHP的蛋白质量分数(83.21%)显著低于THP的蛋白质量分数(92.24%)。一是超滤的次数不够，未能把一些非蛋白组分充分除去；二是膜系统不能把可溶性纤维除去，因为MHP的纤维质量分数(4.52%)确实要高于THP(2.11%)。水分的差异主要是2种蛋白的持水性不同，这和图5显示的MHP持水性要高于THP持水性是吻合的。两者所含的脂肪没有显著差异，说明提取方法对其影响不大。表1显示THP与MHP提取率分别为40.23%、45.37%，显著高于未处理所得的蛋白提取率(16.11%)和仅进行研磨制备的蛋白提取率(35.10%)。可知仅用简单的工艺不能有效地从变性粕提取蛋白，而研磨及热处理可以有效地促进蛋白的溶解，从而提高蛋白提取率。

表1 DDHMS，UDHM，DDHM，MHP和THP的化学组成与提取率

注：表中数据为平均数±标准偏差，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.2 DDHM与UDHM的DSC及特征值

2种火麻粕的DSC及特征值如图1与表2所示。DDHM的热变性温度为98 ℃，低于UDHM的热变性温度99.3 ℃，说明DDHM的结构已遭到一定的破坏。从焓变值也可以发现，本试验的火麻粕焓变较小，仅为5.7 J/g，同样说明在高温榨油过程中，蛋白的三级或者高级结构受到了破坏。

图1 UDDHM与DDHM的DSC

表2 UDHM与DDHM的DSC特征值

注：a变性起始温度，b热变性温度，c吸收峰焓变，d吸收峰半峰宽度。表中数据为平均数±标准偏差，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 火麻蛋白提取工艺优化

2.2.1 胶体磨及热处理影响

火麻蛋白提取工艺的优化采用碱溶酸沉法来进行。由图2可知，胶体磨及热处理对火麻蛋白的提取率有很大的影响。变性火麻粕未通过预处理，蛋白的提取率仅有16.11%，而胶体磨处理的则显著提高提取率，达到35.10%，进一步的热处理之后提取率高达40.23%。主要是火麻粕中蛋白与纤维等其他成分紧密缠绕，而研磨处理可以使颗粒变小，有利于碱液渗入对蛋白的提取；喷射蒸煮可以使物料在高温高压作用下，发生分子重排，使不溶性蛋白形成可溶性聚集体，从而提高了蛋白提取率。因此本试验同时采取胶体磨与喷射蒸煮处理结合的措施来制备火麻蛋白。

注：A未预处理，B胶体磨处理，C胶体磨与热处理。图2 胶体磨及热处理对蛋白提取的影响

2.2.2 料液pH值影响

Zheng等[7]通过试验发现较高pH值可以提高蛋白的分散性和溶解性。图3发现随着pH值从8.0上升到10.0，蛋白提取率出现逐渐上升，从30.11%提高到46.35%。主要是pH值的增加，蛋白质所带的静电荷相应的增加，分子间静电排斥力随之增强，从而使蛋白质微粒解体；解体的蛋白质分子在高温高压作用下，蛋白分子重新排列形成可溶性聚集体。pH大于9时，含硫氨基酸在高温高压过程中，会发生分解，也会产生有毒的物质；高碱环境下使得蛋白中的酚类发生氧化，也会影响产品色泽。因此本试验选取料液的pH为9.0。

图3 pH值对蛋白提取的影响

2.2.3 料液比、搅拌温度及搅拌/研磨时间影响

试验所选的料液比(1∶10、1∶15、1∶20)对提取率影响不大，为35.00%左右；搅拌温度(25、35、45 ℃)以及搅拌/研磨时间(60/10、90/10、60/30 min)也有类似的现象。可能原因是1∶10的料液比已经达到了物料与碱液的最大接触面；室温下蛋白可以充分溶解出来；60/10 min的搅拌/研磨时间可以充分的使蛋白达到最大溶解程度及使物料的微粒达到最小。故选取料液比1∶10、搅拌温度为室温、搅拌/研磨时间为60/10 min作为本试验的优化条件。

2.3 火麻蛋白功能性表征

2.3.1 SDS-PAGE

图4表明与SPI相比，火麻蛋白主要由麻仁球蛋白组成，这和Tang等[4]报道是一致的。在还原条件下与THP相比，MHP多出18.40 ku与27.01 ku 2个带，以及少了46.30 ku带。18.40 ku带可能是清蛋白，这由Tang等[4]报道过；27.01 ku带可能是醇溶蛋白，由于玉米醇溶蛋白也在这个地方呈现条带；而MHP没有出现46.30 ku带，这一条带属于球蛋白的亚基，可能是高压处理过程中该亚基被切断，膜系统的分子截留为80.00 ku，从而该亚基透过了膜。电泳图显示THP具有更多的酸性及碱性亚基，这与图5显示的MHP的溶解性更好是一致的。分子质量小于14.40 ku的也是清蛋白，图中表明MHP具有更多的清蛋白，因而溶解性较好。2种产品在浓缩胶顶部均有少量的条带，说明除了二硫键之外，蛋白之间还有蛋白-蛋白及疏水相互作用。

在非还原状态下，2类产品的条带主要集中在浓缩胶或者分离胶的顶部，这是由于热处理使蛋白形成了聚集体。然而THP仍然有一些酸性亚基条带，表明其具有更多的二硫键。总之MHP具有更多种类的蛋白，因而其氨基酸组成更加丰富；且由于其含有的二硫键少，因而具有更好的溶解性。

图4 蛋白的SDS-PAGE：带1和1’，DDHM；带2和2’，MHP；带3和3’，THP

2.3.2 溶解度与持水性

如图5所示火麻蛋白的溶解度曲线与SPI一样，呈V型，其等电点为pH 5.0。在所有pH条件下MHP的溶解性均好于THP溶解性，表明MHP处于更自然的状态，且会有更广泛的工业应用。这是因为MHP具有更多的清蛋白，且酸沉过程致使某些蛋白发生聚集。pH小于7.0时，两者的溶解性均较差，这个归因于火麻仁球蛋白聚集的发生[8]。然而pH高于8.0时，溶解性马上提高到65%以上，这是因为高pH条件下蛋白质的解聚[8]。

蛋白与水作用的能力取决于很多因素，比如构型、环境条件等。图5表明蛋白的持水性与其溶解度紧密相关，它们随pH变化而变化的趋势是一样的，MHP具有更好的持水性能。在等电点时蛋白/蛋白相互作用最强，因而蛋白/水相互作用变为最弱，从而导致蛋白的持水性最小。中性条件下两者的持水性为16.00～17.00 g/g，这高于Malomo等[6]的报道(12.01 g/g)。

图5 MHP和THP的溶解度曲线及持水性

2.3.3 乳化性与起泡性

由图6a可知，除了pH 2.0和10.0之外，MHP具有更大的乳化活性，这或许是其具有更好的溶解性以及膜法制备的产品具有更为灵活的分子结构。然而在pH 2.0和10.0出现相反的现象，表明此条件下蛋白含量是关键的决定因素。两者在pH 2.0下均具有最好的乳化活性，这可能是多酚等小分子物质在此条件下与蛋白相互作用，形成了较好的构型，从而提高其界面性质。

样品的乳化稳定性随着蛋白在油水界面上的强烈作用而增强[6]。图6b显示在pH 2.0和10.0下两者的乳化稳定性极其高，这与乳化活性的状况是一致的。这归因于越高的溶解度，具备越高的静电荷，因此具有强烈的界面相互作用。在其他pH条件下两者的乳化稳定性差异不大，表明提取方法对其影响不大。从总体上来说，对于某种蛋白而言，其乳化性是与其溶解性呈正相关的。

图6 MHP和THP的乳化性与起泡性

Aluko等[9]指出具有良好起泡性的蛋白具有3个条件：灵活的分子、快速吸附至汽水界面和通过相互作用重排形成稳定的界面膜。图6c表明MHP具有更好的起泡能力，但除pH 2.0外都不及Malomo等[6]所描述的起泡能力，或许是样品浓度和火麻种类的不同。除pH 2.0外，其余条件下两者起泡能力随pH变化而变化的不大。在pH 2.0时两者的起泡能力非常大，Damodaran[10]将这归因于样品疏水性/亲水性比例以及蛋白的聚集状态不同。

如图6d所示，样品的起泡稳定性与其起泡能力相反，THP反而具有更高的起泡稳定性，表明越高的蛋白含量能形成越稳定的气泡。这一现象与Aluko[9]和Malomo等[6]的发现是一致的，Malomo等[6]解释这是由于越多的蛋白形成越多的界面膜来抵抗气泡的崩解。在等电点附近样品的起泡稳定性最大，这是由于此时溶解度降低，随之就是静电荷变少，蛋白之间相互排斥变弱，从而蛋白能更长时间地保留在界面上。

3 结论

以变性火麻粕为原料，探索了胶体磨等因素对火麻蛋白提取的影响，确定最佳工艺：料液比1∶10、胶体磨及搅拌时间分别为10 min和50 min、温度为室温、热处理为130 ℃和90 s、pH 9.0。并利用喷射蒸煮结合超滤技术从变性脱脂火麻粕中制备了火麻蛋白，其蛋白含量与提取率分为83.21%、45.37%；其提取率显著高于未经过胶体磨及热处理所得的提取率(16.11%)，表明研磨及热处理可以显著提高蛋白的溶出率。此外超滤技术制备的火麻蛋白具有较好的功能性质。

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[10]Damodaran S. Amino acids, peptides, and proteins [M]. New York: Marcel Dekker, 1996.

Functional Characterization of Hemp Protein Produced by Jet-Cooking Combined with Membrane Ultrafiltration

Wu Junfeng1Yang Xiaoquan1Zhu Yuanzhuang2
(Research and Development Center of Food Protein, Development of Food Science and Technology,South China University of Technology1, Guangzhou 510640)(Jincheng Hanbao Bio-technology Co., Ltd2, Jincheng 048300)

The effects of colloid mill and others factors on yields of hemp protein are investigated, and the best technological condition is determined, then characterization of hemp protein produced from denatured hempseed meal by jet-cooking combined with membrane ultrafiltration are also investigated. The protein content of membrane hemp protein (MHP) and traditional acid precipitation hemp protein (THP) are 83.21% and 92.24%, respectively; the yields of them are 45.37% and 40.23%, which are significantly higher than that of hemp protein prepared without grinding and jet-cooking processes(16.11%). The gel electrophoresis shows that the compositions of MHP are more abundant and having more healthy roles. The solubility, water holding capacity and foaming capacity of MHP are better, while foaming stability is poorer. At pH 2.0 and 10.0, the emulsifying stability index of MHP and THP are much larger than that of other conditions, and the emulsifying activity index of MHP is slightly larger than that of THP except at pH 2.0 and 10.0. Thus jet-cooking combined with membrane ultrafiltration can significantly improve the yields, and the properties of that are better compared with THP.

denatured hempseed meal, hemp protein, jet-cooking, membrane ultrafiltration, phiscochemical-functional properties

国家自然科学基金(31130042、31371744)，863计划(2013AA102208-3)

2015-08-30

吴俊锋，男，1990年出生，硕士，粮食、油脂及植物蛋白工程

杨晓泉，男，1965年出生，教授，粮食、油脂及植物蛋白工程

TS210.9

A

1003-0174(2017)04-0058-06