益生菌发酵银杏汁饮料的研究与开发

孙达锋，张卫明，张锋伦，朱昌玲，沈娇娇(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042)

益生菌发酵银杏汁饮料的研究与开发

孙达锋，张卫明，张锋伦，朱昌玲，沈娇娇
(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042)

选用银杏果作为原料，通过植物乳杆菌，保加利亚乳杆菌以及嗜热链球菌进行发酵(其菌种比例为1∶1∶3)。主要研究银杏汁的发酵液浓度，饮料体系稳定方法以及发酵过程中的参数，如pH，温度以及活菌数等。通过对益生菌发酵银杏汁的感官及口感的检测，发现银杏果与水的比例为1∶10时最佳。为获得体系稳定的银杏汁，加入中温淀粉酶和中性蛋白酶水解。通过在不同温度下使用乳酸菌发酵银杏汁，得到最适宜银杏汁发酵的温度为40 ℃，发酵时间10 h，乳酸菌发酵银杏汁的pH趋于稳定，在3.47左右，初始活菌数为2×106cfu/mL，其最大活菌数为10 h时达到，为4.7×107cfu/mL，得到香味浓郁，质地细腻，酸味适中以及颜色乳黄的益生菌发酵银杏汁饮料产品。

银杏果；益生菌；发酵；生产工艺

银杏果是银杏科银杏属植物的果实。其营养丰富，据报道含淀粉62.4%，蛋白11.3%，脂肪2.6%，蔗糖5.2%，还原糖1.1%，核蛋白0.26%，矿物质3.0%，粗纤维1.2%[1]。银杏果不仅富含银杏酸、银杏酚、银杏醇、银杏黄素、银杏黄酮、蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、磷、铁、镁、钾、胡萝卜素、维生素等，还含有内酯、胆固醇、聚戊醇等有效成分[2]。银杏果中含有的银杏黄酮具有清除自由基的功能，延缓癌细胞的生长，还能够舒张血管平滑肌，改善心脑等器官循环。白果酸还能抑制一些皮肤真菌和结核杆菌[3]。并且银杏果中的白果酚具有降压作用。近年来的研究还发现，银杏具有美容功能[4]。据《本草纲目》和《本草再新》记载，银杏可食可入药。食则补心养气，益肾润肺，涩精固元，延年益寿；入药可止咳平喘[5]。因此银杏果不仅具有丰富的营养价值，还有较高药用价值。我国具有丰富的银杏资源，对于银杏的开发利用也有了很大的发展。近年来不仅有白果糕点，银杏月饼的制备，还有白果罐头，银杏汁，银杏果茶的生产。银杏果富含碳水化合物，可以作为优质的酿酒原料[5]。另外还发展出以银杏汁为原料，与银耳，红枣等配成的银杏蛋白露和银杏枣汁等[6]。

益生菌对人体具有很高的营养和保健价值。其生长于人体肠道及生殖系统内，有助于维持人体健康以及改善人体微生态的平衡，是对人体有益的一类微生物[7]。如双歧杆菌，嗜热链球菌，植物乳杆菌等。据国内外研究报道，益生菌对人体具有一系列的作用。益生菌可以改善和促进人体肠道健康，增强人体的免疫力，缓解乳糖不耐受患者的症状，降低人体内的胆固醇，帮助人体产生所需的维生素，从而增强人体对营养的吸收和利用以及降低各种疾病的发病率，如肿瘤，肝损伤，结肠癌等[8]。据国内外报道，目前益生菌70%用于乳制品的生产中，如酸奶，奶酪，干酪，乳酸菌饮料以及冰淇淋等。但一部分人对于奶制品中的乳糖具有不耐受性，在饮用奶制品后会出现腹痛，腹泻等情况。目前人们也开始寻求益生菌的其他发酵载体，如蔬菜，水果以及谷物等。还发展出发酵型泡菜，发酵型肉制品和医药保健品等。如日本的一种酪酸梭菌活菌制剂，因对肠道疾病的疗效优于很多制剂，很快跃居我国消化科用药第五位[9]。以及通过嗜酸乳杆菌、长双歧、大肠杆菌发酵的德国药物制剂Omniflora等[10]。

由于银杏果中的营养成分多样，含有丰富的淀粉，蛋白质和糖类等，在加入益生菌发酵后，其可以充分利用银杏果中的物质，转化为更利于人体吸收的成分。一方面补给了人体所需的益生菌数，维持人体微生物群的平衡，另一方面银杏果所具有的营养物质也有利于人体健康。目前，国内外针对益生菌发酵银杏果这方面的研究也并不完善。因此，本研究对银杏果新产品开发具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏果：市购。

菌种：植物乳杆菌(1株)，保加利亚乳杆菌(1株)，嗜热链球菌(3株)(益菌加)。

培养基：MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基

蛋白胨 10.0 g

牛肉粉 5.0 g

酵母粉 4.0 g

葡萄糖 20.0 g

吐温80 1.0 mL

K2HPO4·7H2O 2.0 g

醋酸钠·3H2O 5.0 g

柠檬酸三铵 2.0 g

MgSO4·7H2O 0.2 g

MnSO4·4H2O 0.05 g

琼脂粉 15.0 g

将上述成分加入到1 000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，调至到pH6.2左右，分装后于121 ℃高压灭菌15～20 min。

仪器：YQ-3型海鸥牌匀浆机(江苏省江阴县祝塘仪器厂)；HH-2数显恒温水浴器(金坛市江南仪器厂)；JJ-1大功率搅拌器(常州国华电器有限公司)；20PR-52D离心机(日立工机株式会社)；pHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；SPX-70BⅢ生化培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SW-CJ-1F超净台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；Olympus BH-2显微镜(奥林巴斯光学有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 银杏汁制备流程

银杏果去壳、银杏果煮沸、去皮、制浆、匀浆、煮沸灭菌、酶解、高温灭酶、过滤或离心、冷却、发酵。

1.2.2 银杏汁的发酵

将制备得到的银杏浆汁，放入三角瓶中，加入1%的乳酸菌于水浴锅中密闭发酵，即200 mL银杏汁，加入0.2 g的乳酸菌制剂。

1.2.3 发酵过程中不同温度下pH的测定

在不同温度下(30，35，40，45，50 ℃)于不同时间下(0，2，4，6，8 h)，用pH计测定乳酸菌发酵银杏汁饮料的pH值。

1.2.4 最适温度下不同时间pH的变化

在最适温度下，于水浴锅中发酵，测定(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)下银杏汁的pH值。

1.2.5 最适条件下发酵银杏汁中活菌数的检测

将最适条件下发酵的银杏汁，于(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)取样，在超净工作台中，取1 mL样品到离心管中，用1 mL移液枪取900 μL无菌水于另一灭菌过的离心管中，后加入100 μL样品，以此方法，逐渐10倍稀释。根据待检样品活菌总数的估计，选取2～3个稀释度，进行涂板。每个稀释度吸取100 μL稀释液分别置于MRs平板中，使用L型玻棒进行涂布。后置于37 ℃生化培养箱中，培养48小时后计数平板上的菌落数。随机挑取5个菌落进行革兰氏染色，镜检，并做过氧化氢酶试验。镜检时看到的是革兰氏阳性(被染成紫色)无芽孢球菌或杆菌。同时过氧化氢酶试验为阴性无芽孢杆菌或球菌可判定为乳酸菌[11]。

2 结果与讨论

2.1 银杏汁中加水量对乳酸菌发酵银杏汁饮料的影响

银杏果与水的添加比例的不同，会对银杏汁饮料的稳定性，口感，质感以及色泽产生很大的影响[12]。表1是关于水的添加量不同导致的银杏汁的区别。

表1 不同加水量的银杏汁的区别

因此，较适合于益生菌发酵银杏饮料的银杏果与水的比例为1∶10。

2.2 均质对银杏汁饮料澄清度的影响

均质可以使银杏浆汁中的银杏颗粒降至显微水平，使其中不溶性的大颗粒物质的粒度减少，从而减少各个组分的沉降系数[13]，获得更为稳定的银杏汁液。进而解决银杏果在榨汁后出现的颗粒过大，沉淀浑浊和分层的现象。通过实验发现，经过均质匀浆后的银杏汁要明显澄清，在加热后其糊化分层现象明显减弱。

2.3 淀粉酶对澄清型银杏汁饮料的影响

由于银杏中的淀粉含量高达62.4%，在加热糊化以及发酵过程中会产生大量的沉淀，严重影响了银杏汁的口味，形态和外观品质。因此在实验中，发现加入1%的中温淀粉酶于75 ℃下反应2 h后，其澄清度会稍有改善，并且在加入益生菌后，它在发酵过程中的沉淀会减少，静置稳定性显著提高。

2.4 蛋白酶对澄清型银杏汁饮料的影响

经过淀粉酶水解过后的银杏汁在乳酸菌的发酵下，于6 h后依然会出现絮状沉淀，澄清度下降。根据分析，由于银杏果中含有的11%的蛋白质，在乳酸菌发酵银杏汁的过程中，产生大量的乳酸，pH值下降，使得银杏果浆汁中的蛋白质变性，析出，产生絮状沉淀，严重影响了银杏汁的发酵后的质地和口感。通过加入银杏果量(去壳去皮)1%的中性蛋白酶于50 ℃水浴锅中酶解3～6 h，并过滤后发现银杏汁稍显澄清。在后续的发酵过程中并未出现沉淀分层现象。甚至直到20 h后，也未出现絮状物质，静置稳定性良好。这是由于中性蛋白酶在中性条件下可以迅速的分解蛋白质类物质。从而使得益生菌发酵的银杏汁饮料的澄清度增加。

2.5 不同温度下乳酸菌发酵银杏汁的pH变化

在一系列温度梯度下(30，35，40，45，50 ℃)发酵银杏汁，每隔2 h用pH计测定其pH值。

图1 不同温度下乳酸菌发酵银杏果汁过程中pH随时间的变化

由图1可见，银杏汁发酵之前，其pH值处于中性，约为6.4左右。在加入植物乳杆菌，保加利亚乳杆菌以及嗜热链球菌以后，其pH值在2 h内并未发生明显变化，大致位于6.2，这是由于乳酸菌处于生长迟缓期。菌种需适应其环境，乳酸生成较少。从图还可以看出，在不同的温度下，乳酸菌发酵银杏汁时的产酸能力不同。在温度为40 ℃时，银杏汁的pH值能够最快到达3.53。当温度为35 ℃时，乳酸菌发酵银杏汁的产酸能力次之，在8 h时可以达到3.85。温度为45 ℃时，其产酸能力和在35 ℃下大体一致，8 h后的最终pH值为4.15。图1中还可以看出，当温度为30 ℃或50 ℃时，温度太低或太高并不利于乳酸菌的生长，因此乳酸生成的速度很慢，在8 h后pH的变化仍不明显，分别为4.47和5.43。因此，可以看出，乳酸菌发酵银杏汁的最适温度为40 ℃，在此温度下，其产酸能力最强。

2.6 在最适温度下益生菌发酵银杏汁的pH变化

图2是在最适温度，即40 ℃下，乳酸菌发酵银杏汁的pH随时间的变化曲线。由图可见，在0～2 h内，pH的变化并不明显，由最初的6.47降至6.23。随着时间的变化，乳酸菌逐渐适应银杏汁的环境后，利用银杏汁中的营养快速发酵，进入对数期，乳酸快速生成，银杏汁的pH值显著降低，自2～8 h，其pH值由6.23降至3.53。而8 h以后，乳酸菌的发酵进入稳定期，银杏汁发酵液中的pH值降低速度缓慢，由10 h的3.47到12 h的3.23。由于乳酸的不断生成，抑制了乳酸菌的生长代谢，最终pH值趋于稳定，在15 h和20 h时均为3.07。

图2 乳酸菌发酵银杏果汁过程中pH随时间的变化

2.7 最适温度下益生菌发酵银杏汁饮料的活菌数随时间的变化

在最适温度下，即40 ℃水浴锅中，用乳酸菌发酵银杏汁饮料，分别在(0，2，4，6，8，10，12，15，20 h)时取样，进行涂板培养，于48 h后计数平板上的菌落数，并染色，镜检。

图3 银杏汁发酵中活菌数的变化

细菌的生长周期分为迟缓期，对数期，稳定期和衰退期。由图3可见，在0～2 h时银杏汁中的乳酸菌处于迟缓期，其菌群数由2×106cfu/mL增长到3×106cfu/mL，由于其中的乳酸菌刚刚适应银杏汁中的营养环境，其需要一个短暂的适应过程，有些菌种因对外在环境敏感，无法适应，而造成死亡。迟缓期的乳酸菌菌群数曲线平坦，菌落繁殖很少。处于迟缓期的细胞代谢活跃，体积增大，从介质中能快速吸收营养物质，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP和其他细胞成分等[14]。2～8 h时，银杏汁中发酵的乳酸菌生长进入对数期，期间，细胞快速分裂，这一期细胞数目呈几何级数增加，代时最短，细胞合成核糖体及蛋白质增多。当然这不仅与菌种有关，也与其环境，如温度，pH和培养基成分等相关。8～12h时，乳酸菌的生长进入稳定期。菌群数由8 h的4.2×107cfu/mL生长到10 h的4.7×107cfu/mL，到达12 h时，乳酸菌菌落数维持在3.9×107cfu/mL。此时，新生的细胞数目与死亡的细胞数目相等，总菌落数达到最大值，活菌数保持恒定。银杏汁中的营养物质被逐渐消耗，无法满足乳酸菌的生长需要。而处于稳定期的细菌继续培养，细胞的死亡率逐渐增加，最终群体中获得细胞数目将以对数速率急剧下降，即为死亡期。为图3中的12～20 h时，活菌数最终降低为15 h的1×107cfu/mL和20 h时的4×106cfu/mL。

3 结 论

(1)得到口感最佳，质地细腻，色泽明亮的银杏汁饮料，最适宜乳酸菌发酵的银杏果与水的比例为1∶10。

(2)因银杏果含有大量淀粉和不少蛋白质，若直接制浆发酵，会导致发酵中产生沉淀分层，澄清度下降。为获得稳定性良好，澄清度较高的银杏汁，需通过均质，中温淀粉酶水解，中性蛋白酶水解和离心过滤的方法。

(3)选用的乳酸菌为植物乳杆菌，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，菌种比例为1∶1∶3时，最适宜发酵的温度为40 ℃，最适宜上述菌种发酵银杏汁的时间为10 h，这时，银杏汁的pH为3.47，而在后续的发酵中，即直到20 h时pH降低到3.00，其并不适合乳酸菌的生长。而且10 h时，发酵的银杏汁中的乳酸菌，其达到最高菌群数，即4.7×107cfu/mL，得到香味浓郁，质地细腻，酸味适中以及颜色乳黄的益生菌发酵银杏汁饮料产品。

(4)后续的研究中，还需研究食品添加剂的添加对银杏汁饮料口味的影响，还有在冷藏条件下，益生菌发酵银杏汁饮料贮藏稳定性的变化以及益生菌发酵过后的银杏汁中成分的变化。

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Research and Development of Probiotic FermentedGinkgobilobaJuice Beverage

Sun Dafeng，Zhang Weiming，Zhang Fenglun，Zhu Changling，Shen Jiaojiao
(Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants，Nanjing 210042，China)

Ginkgobilobawas chosen as the raw material，and fermented byLactobacillusplantarum，LactobacillusbulgaricusandStreptococcusthermophilus(the ratio of the strain was 1∶1∶3).The research aimed to study the concentration of the fermentation broth，the stability of the beverage system and the parameters in the fermentation process，such as pH，temperature and the number of viable bacteria.Through the detection of the sense and taste of the fermented juice of probiotics，it was found that the ratio ofGinkgobilobato water was 1∶10.In order to obtain the stability of ginkgo juice，add medium temperature amylase and neutral protease to hydrolize. At different temperatures by using lactic acid bacteria fermented ginkgo juice，get the most suitable ginkgo juice fermentation temperature is 40 ℃ and the fermentation time 10 h，lactic acid bacteria fermented ginkgo juice pH stabilized at around 3.47，the initial number of live bacteria is 2×106cfu/mL，the maximum number of live bacteria occurred at 10 h，4.7×107cfu/mL，get a rich flavor，delicate texture，acidity and yellow probiotic fermented ginkgo juice beverage product.

Ginkgobiloba；probiotics；fermentation；production technology

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.03.017

2016-11-12

孙达锋(1977—)，男，副研究员，研究方向：天然产物。E-mail：sdafeng@163.com

TS275.4

A

1006-9690(2017)03-0078-05