敲除let-7a减轻脑缺血再灌注后炎症反应和神经损伤

胡国章， 刘方方， 方 威， 范 佳

敲除let-7a减轻脑缺血再灌注后炎症反应和神经损伤

胡国章1， 刘方方2， 方 威1， 范 佳3

目的 研究微小RNA let-7a在脑缺血再灌注后神经损伤中的作用及机制。方法 将大鼠分为假手术组、对照组、anti-let-7a组和GFP组，每组各12只大鼠，假手术组大鼠为假手术组。对照组、anti-let-7a组和GFP组分别经尾静脉给予生理盐水、表达anti-let-7a的AAV-9质粒或者对照空质粒实验，然后通过线栓法建立脑缺血再灌注大鼠模型。模型建立24 h后，TTC法检测梗死体积，tunel法检测细胞凋亡，Western blot检测caspase-3表达，ELISA和qRT-PCR检测脑组织中TNF-α和IL-6 的表达。并通过Western blot、qRT-PCR和荧光报告基因验证let-7a对MKP1表达的调控。结果 anti-let-7a组大鼠脑梗死体积明显小于GFP组和对照组，脑组织内凋亡细胞数、caspase-3、TNF-α和IL-6 的表达明显低于GFP组和对照组。let-7a可与MKP1 mRNA 3’UTR端结合，下调MKP1在PC12细胞中的蛋白表达。结论 敲除let-7a可通过调控MKP1表达，抑制MAPK信号通路的激活从而减轻脑缺血再灌注后的炎症反应和细胞凋亡发挥神经保护作用。

脑缺血再灌注； let-7； 凋亡； 炎症； 小胶质细胞

研究发现，脑缺血区域的血流再通后可能会导致进一步的组织损伤和功能障碍，这种有害情况被称为脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤的具体机制不明，大量的实验表明炎症反应在脑缺血再灌注损伤中起到重要的作用。因此，怎样抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应具有非常重要的临床意义，有望成为缺血性脑血管病的治疗途径。MicroRNA (miRNA)是一类仅有18～25个核苷酸的单链组成的一种小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中，在细胞的凋亡、肿瘤的形成以及病毒的复制过程等多方面发挥着多元化调控作用[1,2]。近几年缺血性脑卒中的研究逐步深入化，microRNA作为一种重要的基因水平调控因子，其与脑缺血再灌注的相关研究也相应增多[3]。之前有报道在脑缺血再灌注后，脑组织中let-7a表达显著上调[4,5]，提示其与脑缺血再灌注病理生理过程有关。但let-7a对脑缺血再灌注后神经损伤的影响以及机制尚无相关报道。本研究以脑缺血再灌注大鼠为研究对象，通过let-7a shRNA的慢病毒载体转染研究let-7a敲除对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡以及炎症反应的作用，并对其可能的作用机制进行进一步研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康8～10周龄雄性SD大鼠，体质量220～250 g，由吉林大学动物实验中心提供，各组间暴露因素无差异。

1.2 miRNA转染 将细胞以1×105/ml加入24孔板培养孔中，含10%FBS的1640完全培养基(Gibco)培养24 h，待细胞浓度约为80%，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行转染。let-7a mimic或inhibitor(Ribo,Guangzhou,China)及其阴性对照(Ribo Bio)的转染终浓度均为20 nmol，转染时间为48 h。

1.3 脑缺血再灌注模型建立及处理 将大鼠分为假手术组、对照组、anti-let-7a组和GFP组，每组各6只大鼠，假手术组大鼠为假手术组。对照组、anti-let-7a组和GFP组分别经尾静脉给予生理盐水、表达anti-let-7a的AAV-9质粒或者对照空质粒(由上海吉玛生物科技有限公司代为合成)，然后制作并评估大鼠脑缺血再灌注模型。过程简略如下：大鼠麻醉后,仰卧位固定于手术板上。颈部皮肤消毒后作正中切口，依次分离左侧颈总、颈外及颈内动脉。在颈总动脉和颈外动脉，眼科剪于颈总动脉近端剪一小口，插入直径0.26 mm钝头鱼线，经颈内动脉到达大脑中动脉起始部。阻断左侧大脑中动脉血流2 h后，拔除鱼线，结扎颈外动脉，缝合切口。大鼠复苏后在20 ℃～25 ℃饲养，自由摄水摄食。假手术组大鼠插线未至大脑中动脉，起不到阻断血流的作用，其余步骤与再灌注模型相同。

1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) 缺血再灌注模型制作完成后1 d，所有大鼠麻醉后直接断头处死，取50 mg的脑组织与8倍体积的冰冷碳酸盐缓冲液(100 mmol Na2CO3,50 mmol NaCl pH 11.5)以及蛋白酶抑制剂加入匀浆机中，20 s匀浆。然后将混合物在12 000 g下离心45 min，取上清液进行TNF-α和IL-6 含量的测定，测定方法分别按TNF-α和IL-6试剂盒(Abcam,Hongkong,China)说明书操作。根据标准曲线计算各组每毫克脑组织中TNF-α和IL-6含量。

1.5 qRT-PCR检测mRNA Trizol法提取脑组织总RNA 使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix进行cDNA合成。将2.5 μl合成的cDNA、1 μl特异性引物与TransStartTMSYBR Green qPCR Supermix充分混合后，在ABI 7500 PCR仪(ABI,Bedford,MA,USA)上进行实时定量PCR测定，以GAPDH mRNA内参，定量产物浓度。结果以2-△△CT表示[6]。

1.6 Luciferase assay MKP1基因的3’-UTR端包含1个7 mer大小的序列与let-7a相匹配。将含MKP1 mRNA 3’-UTR的luciferase报告系统(MKP1 3’-UTR-wt)、含突变后的MKP1 mRNA 3’-UTR的luciferase报告系统(MKP1 3’-UTR-mut)和空荧光报告质粒分别与let-7a及其阴性对照mimic-NC共转染至HEK-293细胞中。收集细胞经Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega,Madison,WI,USA)检测荧光强度。

1.7 Western blot 提取细胞蛋白，采取BCA法测定总蛋白浓度。每个样品取总蛋白20 μg与loading buffer混合，电泳后湿法电转膜90 min。转膜后经脱脂牛奶封闭2 h后，TBST洗脱6次(每次10 min)。加一抗兔抗大鼠caspase-3、MKP1和GAPDH多克隆抗体IgG (1∶1000；Abcam,Cambridge,MA,USA)，于4 ℃孵育过夜。次日TBST洗脱6次(每次10 min)。加入HRP标记的二抗羊抗兔多克隆抗体(1∶5 000；Abcam)，室温孵育2 h后行ECL化学发光法显示蛋白条带，结果以蛋白条带的灰度值比值表示。

2 结 果

2.1 抑制let-7a减轻脑缺血再灌注后炎症反应 通过ELISA对再灌注后梗死区内TNF-α和IL-6含量进行检测，可见anti-let-7a组大鼠脑组织中两种炎症介质含量均低于对照组和GFP组(P<0.05)(见图1A)。通过qRT-PCR检测显示，anti-anti-let-7a组大鼠脑组织中TNF-α和IL-6 mRNA明显低于对照组与GFP组(P<0.01)(见图1B)。

2.2 抑制let-7a减轻脑缺血再灌注后神经凋亡 Tunel染色显示假手术组大鼠脑组织无明显Tunel染色阳性细胞，而对照组、anti-let-7a组和GFP组大鼠皮质、海马以及基底节区均可见大量tunel染色阳性的凋亡细胞。anti-let-7a组Tunel阳性细胞百分比明显低于GFP组(P<0.05)(见图2A)。并且通过Western blot检测发现anti-let-7a组大鼠脑梗死灶内caspase-3含量明显低于GFP组(P<0.05)(见图2B)。

2.3 抑制let-7a减轻脑缺血再灌注后神经功能缺损 在脑缺血再灌注后24 h时对脑组织进行TTC染色，结果显示假手术组大鼠脑组织无着色区域，对照组脑梗死区呈苍白色。GFP组大鼠脑梗死范围与对照组分布一致，且两组梗死体积无明显差异(P>0.05)。GFP组相比，anti-let-7a组大鼠脑梗死体积明显减小(见图3A)。实验还对各组大鼠进行了神经功能评分， anti-let-7a组大鼠各时间段神经功能评分均低于对照组和GFP组大鼠(P<0.05)(见图3B)。

2.4 let-7a通过与MKP1 mRNA 3’UTR结合下调其在PC12细胞中的蛋白表达 let-7a mimic可显著降低PC12细胞中MKP1水平(P<0.05)，而let-7a inhibitor可显著升高PC12细胞中MKP1水平(P<0.05)。通过qRT-PCR对Control、let-7a mimic、mimic-NC、let-7a inhibitor、inhibitor-NC共5组PC12细胞中MKP1 mRNA进行检测，结果发现5组细胞中的MKP1 mRNA水平并无明显差异(见图4A)。MKP1 3’UTR-wt组荧光强度明显低于其阴性对照组(miR-con)，而MKP1 3’UTR-mut组或空质粒组荧光强度与其阴性对照无明显差异(见图4B)。此结果表明，let-7a可以通过与MKP1 mRNA 3’UTR端结合而调节其翻译。

与对照组、GFP组相比*P<0.05，与对照组、GFP组相比**P<0.01

图1 抑制let-7a对脑缺血再灌注后的炎症反应的影响

与对照组、GFP组相比*P<0.05，与对照组、GFP组相比**P<0.01

图2 抑制let-7a对脑缺血再灌注后的细胞凋亡的影响

与对照组、GFP组相比*P<0.05，与对照组、GFP组相比**P<0.01

图3 抑制let-7a对脑缺血再灌注后神经损伤的影响

compared to the mimic-NC or 0 h *P<0.01

图4 miR-let7a对PC12细胞中MKP1表达的影响

3 讨 论

let-7家族包括let-7a在内共有11个成员，是最早被发现在物种间高度保守且广泛性表达的miRNAs，也是研究较为成熟的miRNA家族之一。let-7a是研究最广泛的miRNAs之一，既往研究多集中在肿瘤方面，大量证据表明let-7a作为抑癌miRNAs对肺癌、前列腺癌和卵巢癌等不同类型肿瘤的生长和转移起到抑制作用。近年研究发现，let-7a与神经细胞分化以及某些神经系通过疾病也有密切的联系。包括let-7a在内的19种miRNAs在小鼠和人的神经元发育过程中表达增高[7,8]，并且let-7a可通过靶点TLX抑制神经干细胞分化[9]。为了研究let-7a的功能，实验通过尾静脉注射沉默let-7a表达的 AAV9载体使其在脑缺血再灌注大鼠模型脑组织中过表达，结果显示抑制let-7a可减轻脑缺血再灌注后炎症介质TNF-α和IL-6的表达。这些结果均表明脑缺血再灌注后抑制let-7a过度表达具有减轻神经炎症的作用。并且抑制let-7a后脑缺血再灌注所致的神经细胞凋亡和神经功能评分情况也明显改善。

为了寻求let-7a调节脑缺血再灌注后神经炎症和凋亡的具体信号机制，实验通过生物信息学方法发现在丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP1)mRNA 3’UTR上存在let-7a的潜在结合位点。MPK1属于MKPs家族，是由早期应答基因编码的双重底物特异性蛋白磷酸酶，主要分布于细胞核内，主要在丝裂原蛋白活化激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的去磷酸化方面发挥重要作用[10,11]。MKP1是其中效能最高、研究最深、最重要 MAPK磷酸酶，是p38、JNK1/2和ERK1/2负调控的主要因子，因而参与调节炎症反应和细胞凋亡[12～14]。并且有研究表明，MKP1在脑缺血后具有明显的神经保护作用[15,16]。Western blot结果证实，let-7a可下调PC12细胞中MKP1蛋白的表达，而let-7a抑制剂let-7a inhibitor可促进其蛋白表达。qRT-PCR结果发现let-7a对 mRNA表达并无明显影响。通过luciferase assay结果可知，转染let-7a mimic后，含野生型MKP1的3’-UTR段的荧光报告质粒的荧光表达强度明显降低，而含let-7a的结合位点突变的荧光报告质粒的荧光表达强度则不受影响。这些结果表明let-7a可通过结合MKP1的3’-UTR段结合位点在转录后水平抑制MKP1的表达，这一作用并不影响MKP1 mRNA的表达。

综上所述，实验研究发现，脑缺血再灌注后let-7a的表达水平上调，抑制上调的let-7a可减轻脑缺血再灌注后神经炎症反应和细胞凋亡，因而避免神经系统损伤。进一步研究发现，let-7a的促炎症和凋亡作用是通过其靶点MKP1实现的。实验不仅对脑缺血再灌注后炎症反应机制的阐述做出补充，还提示进一步研究针对临床的靶向治疗途径将具有重要的临床意义。

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Knockdown of let-7a attenuates neuroinflammation and nerve injury after cerebral ischemia-reperfusion injury

HUGuozhang,LIUFangfang,FANGWei,etal.

(EmergencyDepartment,TheChina-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To study the role and mechanism of let-7a in cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Rats were divided into Sham group,Control group,anti-let-7a group and GFP group and 6 rats were in each group.Rats in Control group,anti-let-7a group and GFP group were given saline by tail vein,anti-let-7a expression of AAV-9 plasmid or control empty plasmid experiments respectively,and then establish cerebral ischemia and reperfusion model.Infarct volume was examined using TTC staining and apoptosis was evaluated using Tunel staining and caspase-3 detection.The expression of TNF-α and IL-6 in brain tissue was detected by ELISA and qRT-PCR.The regulation of let-7a on the expression of MKP1 was confirmed by Western blot,qRT-PCR and luciferase assay.Results The infarct volume of anti-let-7a group was significantly smaller than that of GFP group and control group,the number of apoptotic cells,the expression of caspase-3,TNF-α and IL-6 in brain tissue were significantly lower than that of GFP group and Control group.Let-7a binds to the MKP1 mRNA 3’UTR end and down-regulates the expression of MKP1 in PC12 cells.Conclusion Knockout of let-7a can inhibit the activation of MAPK signaling pathway by regulating the expression of MKP1,thus excerting the neuroprotective effect against inflammatory reaction and apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion.

Cerebral ischemia-reperfusion; let-7; Apoptosis; Inflammation; Microglia

1003-2754(2017)06-0528-04

2017-04-12；

2017-06-02

(1.吉林大学中日联谊医院急诊医学科，吉林 长春 130033;2.吉林市中心医院神经内科，吉林 吉林 130000;3.吉林大学第二医院神经内科，吉林 长春 130041)

范 佳，E-mail:neurology@139.com

R743.3

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