细胞周期依赖激酶抑制剂Olomoucine对活化星形胶质细胞神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖表达的抑制作用

易善清， 侯 超， 刘 珍， 武 衡

细胞周期依赖激酶抑制剂Olomoucine对活化星形胶质细胞神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖表达的抑制作用

易善清1， 侯 超2， 刘 珍3， 武 衡1

目的 研究细胞周期依赖激酶抑制剂Olomoucine对星形胶质细胞活化后神经蛋白聚糖(Neurocan)、短蛋白聚糖(Brevican)表达的抑制作用。方法 应用睫状神经营养因子(CNTF)刺激法建立体外培养星形胶质细胞的活化模型，实验分3组：对照组、活化组与抑制组。对照组：正常培养的星形胶质细胞；活化组：星形胶质细胞加入20 ng/ml睫状神经营养因子(CNTF)处理24 h；抑制组：星形胶质细胞用20 ng/ml睫状神经营养因子预处理24 h，加入100 μmol/L Olomoucine。应用ELISA法检测不同时间点(12 h、24 h、48 h)各组细胞上清液中Neurocan、Brevican含量变化，半定量RT-PCR检测各组细胞GFAP mRNA及Neurocanm RNA、Brevican mRNA的表达变化。结果(1)活化组上清液中Neurocan、Brevican的含量在12 h、24 h、48 h随着时间的延长逐渐增加，与对照组比较差异有显著性(P<0.01);抑制组上清液中Neurocan、Brevican含量随着时间的延长较活化组明显降低，与对照组、活化组比较差异有显著性(P<0.01)。(2)活化组细胞GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达明显增加，与对照组比较差异有显著性(P<0.01);抑制组细胞GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达均明显下调，与活化组比较差异有显著性(P<0.01)。结论 细胞周期依赖激酶抑制剂Olomoucine可抑制活化星形胶质细胞神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖表达。

星形胶质细胞； Olomoucine； 神经蛋白聚糖； 短蛋白聚糖

星形胶质细胞(astrocyte，Ast)是中枢神经系统的主要组成部分之一，具有多种重要的生物学功能，在调节神经元内外离子平衡、神经营养因子的分泌、能量代谢、神经递质摄取与灭活、突触可塑性等方面具有重要的作用[1]。病理状态下，星形胶质细胞可由静息状态向活化状态转变，活化的星形胶质细胞在早期可分泌大量的神经营养因子促进轴突再生，清除细胞外的毒性物质，保护神经元免受损伤，有利于损伤后神经元的功能恢复；在中晚期，其保护作用减弱，分泌对神经元具有毒性作用的细胞因子，加剧炎症损伤，特别是可以合成抑制轴突生长的细胞外基质成分：硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)类物质。CSPGs是一类由一个核心蛋白和一条或多条共价氨基葡萄糖链(glycosaminogylycan,CAG)组成的大分子家族。CSPGs可分为Aggrecan家族[ 包括聚集蛋白聚糖、神经蛋白聚糖(Neurocan)、短蛋白聚糖(Brevican等)] 、NG2、phosphacan等。研究表明，CSPGs是阻碍CNS损伤后再生的化学屏障的最主要成分，并且可形成胶质瘢痕而抑制轴突再生。在中枢神经系统损伤后，活化的星形胶质细胞中CSPGs(特别是神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖)的表达迅速增加，并在损伤中心区至周边区形成浓度梯度，导致神经再生阻滞[2]，故CSPGs与轴突再生失败有非常密切的关系。

细胞周期依赖激酶(cyclin dependent protein kinases,CDKs)抑制剂 Olomoucine可竞争性与CDKs的ATP位点结合，从而使细胞停滞于G1/S期和G2/M期。本研究应用睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)建立星形胶质细胞活化模型[3]，观察CDK抑制剂Olomoucine对星形胶质细胞活化增殖及CSPGs(主要是Neurocan、Brevican)表达的抑制效应，以明确是否可以通过细胞周期调控达到抑制星形胶质细胞活化，并抑制阻碍轴突生长的细胞外基质成分Neurocan、Brevican的分泌，对以后进一步明确其在中枢神经系统损伤后胶质瘢痕形成中的作用具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 星形胶质细胞的原代培养 取2～3 d SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒，取脑，剔除软脑膜及血管后取大脑皮质，PBS清洗3次，剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶1 ml室温下消化5 min，用培养液(含20%FBS的DMEM)终止消化，1200 rpm离心10 min，弃上清，加入培养液3～5 ml，200目筛网过滤，滤液以1000 rpm离心12 min，弃上清，加入培养液1～2 ml吹打成细胞悬液，接种于20 ml玻璃培养瓶中，37 ℃，用差速贴壁处理去除成纤维细胞，收集星形胶质细胞，将传至第3代的星形胶质细胞用于实验。

1.2 星形胶质细胞活化模型的建立及Olomoucine干预 实验分3组：对照组、活化组、抑制组。对照组：正常培养的星形胶质细胞；活化组：加入20 ng/ml睫状神经营养因子预处理24 h建立星形胶质细胞活化模型；抑制组：星形胶质细胞用20 ng/ml睫状神经营养因子预处理24 h，加入100 μmol/L Olomoucine。于12 h、24 h、48 h检测各组指标变化(每组每个时间点取5孔细胞)。

1.3 ELISA法 用ELISA法检测各组上清液中不同时间点Neurocan、Brevican的含量。

1.4 RT-PCR 用RT-PCR检测各组GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达变化，实验方法参照试剂盒。Neurocan基因特异性引物：上游：5’-CTGCTACCGCTACTTTGCT-3’，下游：5’-CTGGGAGAATCCTTCATCAC-3’；扩增产物长度：457 bp；GFAP基因特异性引物：上游：5’-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3’，下游：5’-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3’；扩增产物长度：274 bp；Brevican基因特异性引物：上游：5’-CCTCGCTGATGACCTGAA-3’，下游：5’-CCGATAGGCTTCGTTTACC-3’；扩增产物长度：253 bp。按照Trizol 试剂盒说明书提取细胞内总RNA ，然后逆转录为cDNA。 PCR反应体系：加入引物、cDNA、PCR预混液和DEPC水，扩增条件为：94 ℃预变性 5min，94 ℃变性 1 min,52 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。最后行产物分析：每孔加取5 μl PCR扩增产物， 加样品缓冲液1 μl,用含溴化乙啶的1.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行拍照并进行电泳条带分析，测定目的基因表达水平，所测指标的mRNA与β-actin比值(相对表达量)作为观察指标，每组标本PCR 重复3次。

2 结 果

2.1 活化星形胶质细胞上清液中Neurocan、Brevican含量明显增加，Olomoucine可抑制星形胶质细胞活化而减少上清液中Neurocan、Brevican含量(见图1、图2)。3组细胞上清液中均可检测到Neurocan、Brevican，活化组上清液中Neurocan、Brevican的含量在12 h、24 h、48 h随着时间的延长逐渐增加，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)；抑制组上清液中Neurocan、Brevican含量随时间延长逐渐下降，在24 h、48 h两个时间点与活化组比较差异有显著性(P<0.01)。

2.2 活化星形胶质细胞上清液中GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达明显增加，Olomoucine可抑制活化星形胶质细胞GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA的表达(见图3～图5)。3组星形胶质细胞中均可见GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达，对照组GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达随时间延长增加不明显；活化组GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表达随时间延长而增强，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。抑制组GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA的表达随时间延长逐渐下调，在24 h、48 h两个时间点与活化组比较差异有显著性(P<0.01)。

与对照组比较*P<0.01；与活化组比较#P<0.01;与活化组12 h比较△P<0.01

图1 各组不同时间点上清液中Neurocan含量比较

与对照组比较*P<0.01；与活化组比较#P<0.01;与活化组12 h比较△P<0.01

图2 各组不同时间点上清液中Brevican含量比较

与对照组比较*P<0.01；与活化组比较#P<0.01;与活化组12 h比较△P<0.01

图3 各组不同时间点GFAP mRNA表达

与对照组比较*P<0.01；与活化组比较#P<0.01;与活化组12 h比较△P<0.01

图4 各组不同时间点Neurocan mRNA表达

与对照组比较*P<0.01；与活化组比较#P<0.01;与活化组12 h比较△P<0.01

图5 各组不同时间点Brevican mRNA表达

3 讨 论

在中枢神经系统中，星形胶质细胞有着复杂而重要的功能，如：突触的形成和传递、维持离子和体液的平衡等。中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生活化，活化后的星形胶质细胞具有双重作用。一方面，它可刺激多种神经营养因子的释放而保护神经元；另一方面，它又可释放许多炎症因子，引起神经元的大量死亡。同时，星形胶质细胞过度增生可促使胶质瘢痕的形成，严重的阻碍了神经修复及轴突的再生[4]。在星形胶质细胞形成胶质瘢痕的过程中，细胞外基质成分-CSPGs起着重要的作用。

研究表明，中枢神经系统损伤后，CSPGs在病灶周围的表达明显上调，在细胞基质中形成阻碍神经再生的抑制性环境，当再生轴突到达CSPGs表达丰富的损伤区时就停止进一步的延伸。CSPGs由核心蛋白和硫酸软骨素(chondr oitin sulfate,CS)、蛋白聚糖 (proteoglycans,PGs)共价连接在蛋白质上组成的一类蛋白聚糖，其中硫酸软骨素-E是阻止轴突再生的关键分子[5]。目前已证明，Neurocan、Brevican、磷酸蛋白聚糖(phos-sphacan)是脑损伤后形成的胶质瘢痕中表达明显上调的CSPGs，与抑制神经再生的作用密切相关。

Neurocan是由163kDa的核心蛋白、3条CS链和一定量的O-连接寡糖链组成，通过与细胞粘附分子、其他CSPGs分子及细胞外基质分子，抑制神经轴突的外生长和突触的形成[6]。在中枢神经系统损伤后，活化的星形胶质细胞可分泌大量的Neurocan到细胞外基质中，并成为胶质瘢痕的重要组成成分，阻碍神经修复与重建[7]。本实验中我们观察到，星形胶质细胞活化后，上清液中Neurocan的含量明显增加，RT-PCR检测发现GFAP mRNA 和Neurocan mRNA表达几乎同时出现明显增强，时间上表现高度重叠，提示Neurocan可能由活化星形胶质细胞合成分泌。

Brevican是所有CSPGs中长度最短的，它阻止过多的树突和轴突往损伤区域延伸，是形成胶质瘢痕抑制轴突生长的重要成分[8]。本研究中我们发现，星形胶质细胞活化后，上清液中Brevican含量随着时间延长逐渐增高，Brevicanm RNA随着时间的延长，表达亦逐渐上调，表明星形胶质细胞活化后Brevican表达增多。

从以上实验我们可以推测，星形胶质细胞活化后分泌较多的Neurocan、Brevican，而Neurocan、Brevican作为CSPGs的重要成分而参与胶质瘢痕的形成，从而阻止轴突的生长。因此，抑制星形胶质细胞增殖在神经损伤后的再生修复中具有重要的意义。

众所周知，细胞增殖是通过细胞周期来实现的，而周期素蛋白(cyclines)和周期素依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinases,CDK)是细胞周期调控的关键分子。Olomoucine是一种CDK 抑制剂，通过竞争性抑制CDK的ATP结合位点来抑制CDK1、CDK2、及CDK5等酶的活性，使细胞周期停滞于G1/S或G2/M转折点，使细胞DNA合成及细胞分裂被阻滞，以抑制细胞的分裂增殖[9]。本研究中，我们发现Olomoucine作用于活化星形胶质细胞后，可抑制GFAP mRNA的表达；同时还发现，活化星形胶质细胞中加入Olomoucine干预后，Neurocan、Brevican的分泌随着时间延长逐渐减少，两者mRNA的表达亦逐渐下调。表明Olomoucine能明显抑制星形胶质细胞的进一步活化，从而使Neurocan、Brevican表达下调。

本实验研究表明，星形胶质细胞活化后，Neurocan、Brevican的表达增高，Olomoucine通过抑制星形胶质细胞的活化，而下调Neurocan mRNA、Brevican mRNA的表达，降低Neurocan、Brevican的分泌。该实验可为神经再生和功能恢复的临床治疗提供新的靶点。

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The expression of brevican and neurocan in the activity astrocytes and Inhibition effect of Olomoucine

YIShanqing,HOUChao,LIUZheng,etal.

(DepartmentofNeurology,AffiliatedNo1Hosipital,NanhuaUniversity,Hengyang421001,China)

Objective To study the inhibitory effect of cell cycle-dependent kinase inhibitor Olomoucine on the expression of neuronal glycoprotein (Neurocan) and short protein oligosaccharides (Brevican) after activation of astrocytes.Methods To establish the activation model of astrocytes cultured in vitro by using ciliary neurotrophic factor (CNTF) stimulation method.The experiment were divided into three groups:the control group,the activation group and the suppression group.Astrocytes in the control group were cultured generally;the activation group were co-cultuted with 20 ng/ml CNTF,and in the suppression group were incubated 100 μmol/L olomoucine.Three groups of cells by different conditions deal with 12,24 and 48 hours later.The content of Neurocan and Brevican were examined by sites sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).RT-PCR was used to detect the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) mRNA,Neurocanm RNA and Brevicanm RNA.Results (1)The content of Neurocan and Brevican in the supernatant of activation group was gradually increased with the duration of 12,24 and 48 h,and the difference was significant compared with the control group (P<0.01).The content of Neurocan and Brevican in inhibition group was significantly decreased with the duration of the activation group,and the difference was significant compared with control group and activation group(P<0.01).(2)The expression of GFAP mRNA,Neurocan mRNA and Brevican mRNA in activation group was significantly increased,and the difference was significant compared with the control group(P<0.01).The expression of GFAP mRNA,Neurocan mRNA and Brevican mRNA decreased markedly,and the difference was significantly compared with activation group (P<0.01).Conclusions Cell cycle-dependent kinase inhibitor Olomoucine inhibits the expression of activated stellate glial cell nerve protein glycoprotein and short protein.

Astrocytes; Olomoucine; Neurocan; Brevican

1003-2754(2017)06-0504-04

2017-02-13；

2017-05-25

衡阳市科技局(2015KJ43)

(1.南华大学附属第一医院神经内科，湖南 衡阳 421001；2.湖南省第二人民医院，湖南 长沙 410001；3.南华大学机能实验室，湖南 衡阳 421001)

武 衡，E-mail:wh720108@sina.com

R741

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