胱硫醚β合酶基因突变在脑梗死患者轻度血管性认知功能障碍中的相关性研究

刘怀翔， 陈金来， 路 蔚

胱硫醚β合酶基因突变在脑梗死患者轻度血管性认知功能障碍中的相关性研究

刘怀翔1， 陈金来2， 路 蔚1

目的 研究同型半胱氨酸(homocystine,Hcy)代谢基因胱硫醚β合酶(cystathionine βsynthase,CBS )基因T833C突变在急性脑梗死后轻度血管性认知功能障碍(vascular cognitve impairment,VCI)中的价值研究。方法 采用扩增阻滞突变体系法检测CBS T833C基因型，对急性脑梗死分别行入院时、14 d、30 d和90 d时蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)和简易精神状态量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)评分。结果 Logistic回归分析显示Hcy可能是轻度VCI的独立危险因素(OR为1.274；95%CI1.027～1.264，P=0.018)；空腹高同型半胱氨酸血症(Hhcy)组 14 d、30 d和90 dMMSE和MoCA评分分别低于Hcy水平正常组(P<0.01或0.05)；各基因型入院时MMSE和MoCA评分无差别(P>0.05)，而入院14 d时，C/C型MMSE和MoCA评分低于T/T型(P<0.05)，随访30 d和90 d时， C/C型MMSE和MoCA评分趋势是低于C/T和T/T型(P<0.01或0.05)，C/T型低于T/T型(P<0.01或0.05)。结论 CBS T833C基因突变可能是引起Hhcy，间接促进了脑梗死患者VCI事件的出现，可能是VCI的遗传易感因素。

脑梗死； 胱硫醚β合酶； 同型半胱氨酸； 认知功能障碍

研究结果显示，急性脑梗死后轻度VCI的危险因素与传统的卒中危险因素相同，目前对VCI尚无特殊处理手段，控制卒中的危险因素对预防VCI可能有效，尤其是老年患者，血管性疾病是认知功能减退的重要原因[1,2]。目前已证实Hhcy是缺血性血管病独立的危险因素，而且亦是VCI的危险因素之一[3,4]，而Hcy代谢的关键酶CBS基因突变，可造成Hcy水平异常升高。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年6月-2016年5月住院的动脉硬化性急性脑梗死患者180例(急性发病3 d内)，均经头部MRI和MRA、CTA或DSA显示出急性病灶或闭塞血管。年龄60～80岁，平均(65.54±7.18)岁，男性123例，女性57例，分别予以入院时、14 d、30 d(±3 d)和90 d(±3 d)行MoCA和MMSE评分，且所有入选病例MMSE和MoCA均为正常或轻度VCI患者。除外甲状腺疾病、房颤、严重心、肺、肝、肾功能障碍、血液系统疾病和服用卡马西平、叶酸及B族维生素制剂病史患者，其它疾病造成的认知功能损害(如阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、路易体痴呆、帕金森病、亨廷顿病、焦虑抑郁症)。发现高Hcy血症患者后，均给予叶酸5 mg/d，甲钴胺1500 μg/d，同时轻度VCI患者均给予多奈哌齐5 mg/d。所有入选患者均于急性发病3 d内，分别予入院时、14 d、30 d和90 d(门诊复查或家访时)时行MoCA和MMSE评分。

1.2 方法

1.2.1 Hcy水平及生化指标 Hcy水平及生化指标测定由BS-2000M全自动生化分析仪完成，Hcy水平参考值范围5.46～16.2 μmoml/L。

1.2.2 MMSE 测试 根据文化程度，MMSE 分值：文盲≤19分，小学≤22分，初中及以上≤26分为认知障碍；文盲17～9分，小学20～22 分，初中及以上24～26分为轻度认知功能障碍；MoCA 测试：评分≥26分为没有认知功能障碍，在21～26为轻度认知功能障碍，<21 分为痴呆，对受教育年限在12 y及以下的被测试者加1分，最高分为30分。

1.2.3 CBS基因多态性分析 受试者(均于发病3 d内)当日晨，均空腹抽取静脉血2 ml，以2%的EDTA抗凝，-70 ℃保存待检测。采用扩增阻滞突变体系法检测CBS基因型。用TKM法提取基因组DNA。CBS扩增引物序列参考文献[5]，扩增CBS基因的反应条件为：94 ℃变性5 min，94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环30次，72 ℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，扩增片段大小为870 bp,分为纯和突变型C/C、杂和型C/T及野生型T/T，结果(见图1)。

2 结 果

2.1 空腹Hhcy组和Hcy水平正常组一般资料和临床实验指标对比 空腹Hhcy组患者中合并高血压、冠心病、饮酒危险因素所占的比例均高于Hcy水平正常组，具有统计学显著意义(P<0.05)，Hhcy组LDL水平高于Hcy水平正常组(P<0.05)，结果(见表1)。

2.2 空腹Hhcy组和Hcy水平正常组不同时间MMSE和MoCA评分比较 空腹Hhcy组14 d、30 d和90 d MMSE和MoCA评分分别低于Hcy水平正常组(P<0.01或0.05)，入院时两组MMSE和MoCA评分比较均无统计学意义(P>0.05)，结果(见表2)。

2.3 各血管病危险因素与VCI的关系 以0.05、0.10分别作为入选和剔除自变量的显著性水平，将年龄、性别构成、高血压、冠心病和糖尿病患病率、吸烟率、饮酒率、CBS基因型、TC、TG、Glu、LDL、HDL、BMI、Hcy水平按其作用大小依次引入回归方程。 结果最终选入回归模型的有糖尿病、高血压、LDL、HDL、TC、Hcy，其P值分别为0.025、0.008、0.034、0.003、0.029和0.018，结果(见表3)。

2.4 CBS不同基因型Hcy水平及各观察点MoCA和MMSE评分比较 C/C型Hcy水平高于C/T和T/T型(P<0.01)，C/T型高于T/T型(P<0.01)；各基因型入院时MMSE和MoCA评分无差别(P>0.05)，而入院14 d时，C/C型MMSE和MoCA评分低于T/T型(P<0.05)，随访30 d和90 d时， C/C型MMSE和MoCA评分趋势是低于C/T和T/T型(P<0.01或0.05)，C/T型低于T/T型(P<0.01或0.05)，结果(见表4)。

表1 空腹高Hcy血症组和Hcy水平正常组一般资料和临床实验指标对比[%(例)， ±s]

Hhcy组和正常组比较*P<0.05

表2 空腹Hhcy组和Hcy水平正常组不同时间MMSE和MoCA评分的比较

正常组和Hhcy组比较*P<0.05，**P<0.01

表3 VCI各血管病危险因素Logistic回归分析

*P<0.05，**P<0.01

表4 CBS不同基因型Hcy水平及各观察点MoCA和MMSE评分比较(例，

①为C/C基因型；②为C/T基因型；③为T/T基因型，*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

在我们国家，血管性痴呆是仅次于Alzheimer病引起痴呆的第二位常见病因，轻度认知功能障碍是痴呆的高危人群，是其前期表现和预防痴呆的关键阶段。近年来有研究报道，Hhcy是血栓性脑血管病的独立危险因素，同时也是VCI的独立危险因素[3,4,6]。

本研究Logistic回归分析显示除传统危险因素高血压、糖尿病、TC以外，Hhcy是脑梗死患者轻度VCI的独立危险因素，与前述观点基本一致，而CBS T833C基因突变并未进入回归模型，显示其并非轻度VCI的独立危险因素，结合国外Sungeun Kim等[7]研究，分析其原因可能为CBS基因突变对脑梗死患者轻度VCI产生影响是通过改变血浆Hcy水平实现的，但同时血浆Hcy水平还受到MTHFR基因型、蛋氨酸合成酶基因型以及血浆维生素水平等多重因素影响，故而CBS T833C基因突变在本研究Logistic回归分析中成为“干扰因素”被剔除，如对影响血浆Hcy水平的所有因素均进行测定和分析，CBS T833C基因突变可能就会进入Logistic回归模型而成为独立危险因素。 CBS是体内Hcy分解代谢的关键酶，其有多个突变位点，T833C位点突变是其最常见突变位点[8]，使其编码的异亮氨酸代替苏氨酸，引起CBS结合位点的构象变化，从而影响酶的活性，进而影响体内Hcy的代谢，导致Hhcy的发生。

本研究结果显示，脑梗死患者C/C型Hcy水平高于C/T和T/T型(P<0.01)，C/T型高于T/T型(P<0.01)，证实CBS基因是脑梗死患者Hcy水平异常增高的关键代谢基因，同样的研究结论多有报道[9～11]。

本研究通过对空腹Hhcy组和Hcy水平正常组脑梗死患者的随访发现，空腹Hhcy组14 d、30 d和90 d MMSE和MoCA评分分别低于Hcy水平正常组(P<0.01或0.05)，而入院时两组MMSE和MoCA评分比较均无差别(P>0.05)，随着观察时间点的延长，MMSE和MoCA评分值逐渐增加的趋势，可能与病情恢复、药物干预及补充叶酸和甲钴胺等有关，除两组入院时评分无差别外，其它各观察点均低于Hcy水平正常组，可能说明Hhcy通过一系列的损害机制，造成患者认知功能的下降，同时延迟认知功能恢复。Morris MS[12 ]研究同样发现，Hcy水平升高与MMSE评分下降相关，随着对观察对象随访时间的延长，这种趋势愈加明显，同时发现MMSE评分下降与叶酸和甲钴胺水平下降相关。同样Nilsson K,等[13]研究发现升高的Hcy可能是血管性痴呆的标记物。国外多数研究表明[8,14,15]，Hhcy引起VCI的可能作用机制为：(1)直接损伤血管内皮细胞;(2)影响血管平滑肌细胞的迁移及增殖;(3)干扰抗凝和纤溶系统;(4)影响脂质代谢紊乱从而促进动脉粥样硬化;(5)促进神经元的凋亡;(6)有神经兴奋的毒性作用，使得β淀粉样蛋白毒性增强;(7)影响神经传导功能。

本研究对180例脑梗死患者CBS T833C基因多态性随访中发现，各基因型入院时MMSE和MoCA评分无差别(P>0.05)，而入院14 d时，C/C型MMSE和MoCA评分低于T/T型(P<0.05)，在随访30 d和90 d时，C/C型MMSE和MoCA评分趋势是低于C/T和T/T型(P<0.01或0.05)，C/T型低于T/T型(P<0.01或0.05)，说明CBS T833C基因突变对脑梗死患者VCI产生影响，而C/C和C/T型对认知功能障碍的恢复有着不利的影响。总之，CBS T833C基因突变可导致Hhcy的发生，进而间接促进了脑梗死患者VCI事件的出现，可能是VCI的遗传易感因素，在痴呆预防工作中，特别是缺少传统危险因素的患者，行CBS T833C基因检测是必要的，虽然目前遗传因素仍不能干预，但及早发现Hcy水平异常升高对VCI的预防有着积极预测价值，并进行针对性的干预。

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The correlation research of cystathionine βsynthase gene mutation on mild vascular cognitve impairment with cerebral infarction

LIUHuaixiang,CHENJinlai,LUWei.

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211,China)

Objective To study the value of the homocystine metabolic gene T833C polymorphism of cystathionine βsynthase (CBS) in the mild vascular cognitve impairment (VCI) after acute cerebral infarction.Methods CBS T833C genetyp was analyzed by PCR-ARMS technologies.Acute cerebral infarction were separately on admission,14 days,30 days and 90 days with Montreal Cognitive Assessment scale(MoCA) and Mini-getting the State Examination (MMSE) score.Results Logistic regression analysis showed that Hcy may be independent risk factors for mild VCI(OR=1.274;95%CI1.027～1.264;P=0.018).The comparison of 14 days,30 days,90 days MMSE and MoCA scores with fasting plasma hyperhomocysteinemia patients were respectively lower than that of normal Hcy levelgroup (P<0.01 orP<0.05).Comparing different genotype scores,there were not difference on admission(P>0.05),C/C genotype MMSE and MoCA scores were respectively below T/T genotype on hospital 14 days(P<0.05),follow-up 30 and 90 days,C/C genotype scores trend of MMSE and MoCA were below C/T and T/T genotypes(P<0.01 orP<0.05),C/T genotype score was lower than T/T genotype (P<0.01 orP<0.15).Conclusions CBS T833C gene mutations can lead to hyperhomocysteinemia,indirectly promote the emergence of VCI events with cerebral infarction patients,may be a genetic susceptibility factor of VCI.

Cerebral infarction; Cystathionine βsynthase; Homocystine; Vascular cognitve impairment

1003-2754(2017)06-0519-04

2017-02-24；

2017-05-25

天津市卫计委科技基金(2015KZ095)

(1.天津医科大学第二医院神经内科，天津 300211；2.天津医科大学第二医院检验科，天津 300211) 通迅作者：刘怀翔，E-mail：liuhuaixiang2002@sina.com

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