雷帕霉素对PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用

齐倩倩， 常明则， 张格娟， 李 斌， 史文珍， 李仕林， 田 晔

雷帕霉素对PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用

齐倩倩， 常明则， 张格娟， 李 斌， 史文珍， 李仕林， 田 晔

目的 探讨雷帕霉素对PC12细胞氧糖剥夺损伤(oxygen and glucose deprivation,OGD)的作用。方法 选取处于对数生长期的PC12细胞，分为正常组、OGD组、溶剂组和1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素组，OGD同时给予雷帕霉素处理，8 h后通过倒置显微镜观察细胞形态学的变化、MTT法检测细胞存活率的变化以及LDH活性检测细胞受损程度。结果 与正常组相比，单纯OGD组细胞活性明显下降，且具有统计学意义(P<0.05)；与溶剂组相比，1、10、100、500 nmol雷帕霉素组细胞存活率均存在不同程度的增高，其中10、100、500 nmol组具有统计学意义(P<0.05)。结论 雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤具有保护作用。

PC12细胞； OGD； 雷帕霉素

脑梗死是导致人类死亡的三大主要疾病之一，存活者50%～70%患者遗留有严重残疾，给家庭和社会带来了沉重的负担[1,2]。然而，脑梗死至今仍缺乏安全有效的治疗措施，目前应用的溶栓治疗虽然具有肯定效果，但是因其严格的时间限制和出血等严重并发症使其应用受限。因此积极寻找有效的治疗药物势在必行。雷帕霉素是从吸水链霉菌属中提炼出来的一种新型大环内酯类抗生素，其最初作为一种抗真菌药物使用[3～5]。近年来有研究表明，雷帕霉素在神经系统退行性疾病中发挥着保护作用，但是其在脑梗死中的作用仍不明确。本文采用PC12细胞氧糖剥夺模型，给予不同浓度的雷帕霉素干预，通过观察细胞形态学的改变以及细胞存活率的变化，探讨雷帕霉素在PC12细胞OGD损伤中是否发挥保护作用；为脑梗死治疗提供新的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 1640培养基、MTT、胎牛血清和胰酶均购于西安依科生物有限公司，DMSO、马血清购于Sigma公司； Rapamycin，购于Cayman Chemical公司；真空干燥器，四川蜀牛公司；二氧化碳细胞培养箱，Sellab公司；倒置激光共聚焦显微镜FV300，Olympus公司；超净工作台，Airtech公司，酶联免疫检测仪，Biotek公司；96孔板震荡仪，Thermo公司；多温度式水浴锅，上海精宏公司。

1.2 实验细胞及其分组 PC12细胞，购于上海中科院；选取处于生长对数期的细胞，随机分为以下7组：正常组、单纯OGD组、溶剂组和1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素组。

2 实验方法

2.1 PC12细胞培养 PC12细胞培养液为完全培养基(1640培养基+5%胎牛血清+10%马血清+1%青霉素-链霉素100×)，置于37 ℃、95% CO2、5% O2孵箱中培养，隔日换培养基，当细胞汇合度达80%左右，进行细胞传代。

2.2 OGD模型的建立 选取生长状况良好的PC12细胞，消化离心后以适宜的密度接种于96孔板或者培养瓶中。把含血清的培养液换成无糖无血清的Hepes缓冲液，然后将96孔板或培养瓶放在缺氧装置中(装置见图1)。用电动吸痰器抽尽装置内的空气，然后小流量充入氮气和二氧化氮的混合气体，最后放入37 ℃的细胞培养箱中培养一定的时间。

2.3 MTT 选取处于生长对数期的细胞，按照4×105密度，200 μl接种于96孔板中。每孔加入20 μl的MTT溶液，锡箔纸避光，放入37 ℃培养箱中孵育4 h。4 h后取出96孔板，小心吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO，在96孔板震荡仪中震荡10 min，充分溶解紫色结晶。在酶联免疫检测仪上检测各孔的吸光度值(OD)，选取波长为490 nm，记录结果。

2.4 LDH 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性检测，在一定程度上可判断细胞受损情况。LDH在正常情况下存在活细胞胞浆中，在缺氧等应激环境中可导致细胞膜通透性发生变化，胞浆中的LDH即被释放到细胞外，LDH释放量与细胞的死亡数近似成正比，与吸光度成正比。因此，检测细胞培养液中的LDH释放量，可以反映细胞的损伤程度。

3 实验结果

3.1 OGD模型的成功建立 正常情况下，细胞形态呈不规则圆形，细胞透光性强，贴壁生长；单纯OGD组细胞数量明显减少，部分细胞漂浮，贴壁细胞胞体略变小，透光性较差(见图2A)。MTT结果显示：与正常组相比，单纯OGD组细胞相对活性下降约43%，具有显著的统计学意义(P<0.001)，证明OGD模型成功建立(见图2B)。LDH活性检测法得到的结果与MTT比色法趋势一致，与正常组相比，单纯OGD组LDH活性增加约6倍，具有显著的统计学意义(P<0.001)。

3.2 雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤具有保护作用 与单纯OGD组相比，溶剂组细胞形态学并未发生明显改变，细胞数量也没有明显减少，说明DMSO对细胞没有明显的毒副作用。与溶剂组相比，雷帕霉素组细胞数量明显增多，形态呈不规则状(见图3A)。与正常组相比，单纯OGD组和溶剂组细胞存活率均明显下降，存在统计学意义(P<0.05)，单纯OGD组和溶剂组两组之间无统计学意义(P>0.05)(见图3B)。与溶剂组相比，雷帕霉素组细胞存活率增加(P<0.05)。

3.3 不同浓度雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤的保护作用 与正常组相比，单纯OGD组细胞密度减少，部分细胞漂浮，细胞变小形态变圆，状态较差。不同浓度雷帕霉素组的细胞数量比溶剂组增多，且以100 nmol浓度的雷帕霉素最明显(见图4A)。MTT结果显示：与正常组相比，单纯OGD组细胞活性下降约50%；与溶剂组相比，10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素组细胞的存活率均有不同程度的升高(P<0.05)，其中100 nmol作用最明显(见图4B)。LDH活性检测也得到了类似趋势，与正常组相比，单纯OGD组LDH释放量增加约6倍。与溶剂组相比，10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素处理组LDH的释放量均不同程度的降低，均有统计学意义(P<0.05)(见图4C)。同样100 nmol作用最明显，且P<0.001，具有统计学意义。

图1 OGD装置示意图

图3 A：雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤后形态学的影响。B：雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤后存活率的影响。Vehicle=DMSO，标尺=50 μm，n=3，与control比较*P<0.05;与Vehicle比较#P<0.05

图4 A：不同浓度雷帕霉素对PC12细胞形态学的影响。B：不同浓度雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤后存活率的影响。C：不同浓度雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤后LDH活性的影响。Vehicle=DMSO，n=3，与control比较*P<0.05，**P<0.001；与Vehicle比较#P<0.05，##P<0.001

4 讨 论

本文中采用的OGD装置是本课题小组自制，其具有密闭性良好、体积小和操作简单方便等优点，可以较好地模拟脑缺血。

雷帕霉素是一种新型大环内酯类抗生素，最初作为抗真菌药物而应用于临床，后来又逐渐发现了其它功能，如免疫抑制作用和抗增殖特性等等。近年来，研究者发现雷帕霉素在神经系统退行性疾病中具有保护作用[6～8]。在脑缺血损伤领域中虽然也有相关的研究，但是关于雷帕霉素的作用尚未统一，仍然存在争议。因此，仍然需要大量的实验来明确雷帕霉素在脑缺血损伤中的作用。2011年Chauhan A等研究者发现在SD大鼠MCAO模型中，成功建模1 h后给予不同浓度的雷帕霉素(50 g/kg、150 μg/kg、250 μg/kg)干预，发现给予150 μg/kg、250 μg/kg雷帕霉素实验组大鼠受损的运动功能得到改善，并且显著地逆转了丙二醛、谷胱甘肽、一氧化氮和髓过氧化物酶等炎症因子水平的增加，从而发挥了神经保护作用[9]。Tomasz Urbanek等研究者发现，在HUVEC细胞OGD同时给予100 nmol雷帕霉素干预6 h后，提高了细胞存活率。由此可见，上述研究者均认为雷帕霉素在脑梗死动物模型中发挥神经保护作用[10]。然而也有部分研究者持相反观点，认为雷帕霉素加剧了脑缺血损伤。2015年Weiner GM等研究者发现在胎鼠原代神经元OGD模型中，OGD同时给予雷帕霉素干预，雷帕霉素组细胞LDH释放量增加，说明在该实验条件下雷帕霉素是加重神经元损伤的。同时在体实验中发现雷帕霉素

增加了脑梗死体积[11]。Maria Dolores P等研究者发现在原代星形胶质细胞OGD模型中，给予雷帕霉素干预后加剧了细胞的死亡[12]。关于雷帕霉素在脑缺血损伤中矛盾的角色，可能与模型建立、研究对象、给药时间、给药浓度和研究条件的不同有一定的关系。

在本实验中，PC12细胞OGD 8 h后，与正常组相比，单纯OGD组细胞存活率下降约50%。而给予1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素干预后，与溶剂组相比，细胞存活率均存在不同程度的增高，100 nmol组细胞存活率最高。其中10、100、500 nmol均具有统计学意义。因此在本实验中，浓度为10 nmol、100 nmol和500 nmol的雷帕霉素对PC12细胞的OGD损伤均具有保护作用，且以100 nmol作用最为明显。在接下来的实验中，本课题小组将继续探讨雷帕霉素发挥保护作用的机制，为雷帕霉素的临床应用提供一定的理论基础。

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The effect of rapamycin on PC12 cells injured by oxygen and glucose deprivation

QIQianqian,CHANGMingze,ZHANGGejuan,etal.

(DepartmentofNeurology,Xi’anNo.3Hospital,Xi’an710018,China)

Objective To investigate the effect of rapamycin on PC12 cells injured by oxygen and glucose deprivation.Methods The PC12 cells which in the logarithmic phase were randomly divided into control,OGD,vehicle,1,10,100,500 nmol rapamycin groups.Rapamycin was added to the medium directly at the start of OGD.We observed the morphology changes of PC12 cells by inverted microscope after OGD,evaluated the survival rate of PC12 cells challenged with the MTT assay.Results Compared with the control group,the PC12 cells activity of OGD group was significantly decreased (P<0.05),compared with the vehicle group,the cell survival rates of 1,10,100,500 nmol rapamycin groups were increased in a varying degrees,and cell survival rates of the 10,100,500 nmol have statistically significant (P<0.05).Conclusion Rapamycin has a protective effect in OGD injury of PC12 cells.

PC12 cell; OGD; Rapamycin

1003-2754(2017)06-0494-03

2016-12-15；

2017-03-29

国家自然科学基金(No.H0906)；陕西省自然科学基金(No.2014JM4139)

(陕西省西安市第三医院神经内科，陕西 西安 710018)

田 晔，E-mail：chhty@sina.com

R743.3

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