HSYA与芍药苷联用对脑缺血再灌注损伤大鼠海马区脑组织与血浆CD62P的影响

吴丽彩，余梦黎，廖金明，徐愉林，郑丽娴，姚 晖，秦莎莎*，张继平*

（1.南方医科大学顺德医院，广东佛山528300；2.广东医科大学药学院，广东湛江524023；3.南方医科大学中医药学院，广东广州510515；4.南方医科大学附属佛山医院，广东佛山528000；5.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

HSYA与芍药苷联用对脑缺血再灌注损伤大鼠海马区脑组织与血浆CD62P的影响

吴丽彩1，余梦黎2，廖金明3，徐愉林2，郑丽娴3，姚 晖4，秦莎莎5*，张继平4*

（1.南方医科大学顺德医院，广东佛山528300；2.广东医科大学药学院，广东湛江524023；3.南方医科大学中医药学院，广东广州510515；4.南方医科大学附属佛山医院，广东佛山528000；5.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

目的HSYA与芍药苷联合用药对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织与血小板活化的影响。方法SPF级雄性SD大鼠，随机分为HSYA组（5.0mg·kg-1）、芍药苷组（5.0mg·kg-1）HSYA与芍药苷联合用药组（合用组）（各5.0mg·kg-1）、银杏内酯组（5.0mg·kg-1）、模型组和假手术组。大脑中动脉线栓法复制脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血1 h再灌注6 h后尾静脉注射给药7 d，末次给药2 h后收集相应标本保存；苏木精-伊红（HE）染色法观察海马区神经细胞形态变化；流式细胞仪（FCM）法检测全血中P-选择素(CD62P)含量。结果HE染色结果提示，与模型组比较，HSYA、芍药苷及合用组均能明显改善急性脑缺血再灌注大鼠海马区神经细胞的损伤程度，以合用组尤为明显。FCM结果提示，与假手术组比较，模型组大鼠全血中CD62P的活化程度显著增加（p＜0.01）；与模型组相比，合用组与银杏内酯组均能显著抑制全血中CD62P的活化程度（p＜0.05）；与合用组相比，芍药苷组全血中CD62P的活化程度显著增加（p＜0.01），但HSYA组与合用组之间抑制作用无显著性差异。结论HSYA与芍药苷联合用药对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的的海马区神经细胞保护机制可能与抑制CD62P表达有关。

HSYA；芍药苷；血小板活化

脑卒中具有死亡率、发病率、致残率和复发率高及并发症多的特点，约80%的脑卒中属于缺血性脑卒中［1］。随着中国人口老龄化的进程，急性缺血性脑卒中不仅成为中国第一位死因，且患病率呈上升趋势及年轻化趋势［2-3］。研究发现［4-6］，羟基红花黄色素A（HSYA）与芍药苷单独应用及二者联合用药对脑缺血再灌注损伤都具有保护作用。脑卒中的发生发展与血小板的活化密切相关［7-5］。本文通过改良线栓法复制局灶性脑缺血再灌注模型，观察全血中血小板活化标记物CD62P活化程度及海马组织的病理变化，探讨HSYA与芍药苷联合用药对抗脑缺血再灌注损伤的保护机制与血小板活化的关系。

1 材料与方法

动物SPF级雄性SD大鼠120只，体质量180～220 g，广州中医药大学（大学城）实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（粤）2013-0020；SPF级动物饲养环境由广东药科大学实验动物中心提供，许可证号为SYXK（粤）2012-0125。

1.1 药物及试剂

HSYA（纯度89.5%，成都康邦生物科技有限公司，批号160301）；芍药苷（纯度98%，南京泽朗生物科技有限公司，批号20150723）；银杏内酯注射液（成都百裕科技制药有限公司，批号08150404）；FITC标记的大鼠IgG1、CD62P抗体（批号SC-2855），PE标记的大鼠IgG1（SC-2866），均来自美国Santa Cruz公司。

1.2 仪器

流式细胞仪（美国BD公司），石蜡切片机（德国徕卡仪器公司），BMJ—A型包埋机（常州市中威电子仪器有限公司），普通光学显微镜（苏州倍特嘉光电科技公司）。

1.3 分组及给药

SPF雄性SD大鼠120只，随机分为6组，每组20只：HSYA组（5.0mg·kg-1）、芍药苷组（5.0mg·kg-1）、HSYA与芍药苷联合用药组（合用组）（各5.0 mg·kg-1）、银杏内酯组（5.0 mg·kg-1）、模型组和假手术组（等量生理盐水）。适应性饲养1周后，复制脑缺血再灌注模型。脑缺血1 h再灌注6 h后尾静脉注射相应的药物给药7 d，每天1次。

1.4 模型复制

3%戊巴比妥钠（3 ml/·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，参照文献［9］方法沿颈部正中线纵向切口，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。使线栓通过CCA分叉部进入ICA，结扎ICA切口和栓线，1 h后抽出栓线，再灌注6 h，造成大脑中动脉栓塞（MCAO）动物模型。假手术组除了不插线栓，其余同手术组。

1.5 检测指标

1.5.1 海马区脑组织病理

颈椎脱臼处死大鼠，开颅取脑，参照文献［10］的方法进行大鼠脑组织HE染色，光镜下观察海马区神经细胞的形态学变化。

1.5.2 检测血浆CD62P含量

大鼠麻醉后，腹主动脉取血2ml于3.8%枸橼酸钠抗凝管，取5μl全血分别加入事先置有单抗的流式管内，其中对照管（每组两个对照管）含Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE各5μl，实验管含CD61-PE、CD62P-FITC各55μl，室温暗处孵育20 min，各管在分别加入1ml预冷（2-8°C）1%多聚甲醛，充分混匀，2-8°C避光放置30min，然后上机检测。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件，实验数据均以±s表示，采用单因素方差分析（One-WayANOVA），p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

（1）对急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马区脑组织的影响假手术组海马CA1区结构清晰完整，未见明显损伤及病变；模型组海马CA1区大量液化性坏死，结构不清晰，神经细胞大量坏死，未见正常神经元细胞；与模型组比较，给药组海马CA1区部分细胞排列紊乱，细胞皱缩，体积缩小，与周围细胞分离，嗜酸性变及凋亡，且HSYA与芍药苷联合用药对脑损伤的改善程度较二者单独用药好，见图1。

（2）对全血CD62P含量的影响与假手术组相比，模型组组大鼠全血CD62P的活化程度显著增加（p＜0.05）；与模型组相比，合用组、银杏内酯组全血CD62P的活化程度显著降低（p＜0.05）；与合用组相比，HSYA组CD62P活化程度显著增加（p＜0.05），见表2。

图1 各组海马CA1区细胞形态变化（HE，×400）

表2 HSYA与芍药苷联用对CD62P活化程度的影响（±s，%）

表2 HSYA与芍药苷联用对CD62P活化程度的影响（±s，%）

注：与假手术组比较，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05；与合用组比较&&p＜0.01

组别HSYA组芍药苷组合用组银杏内酯组模型组假手术组N 5 6 8 7 9 7 CD62P 0.264±0.123 0.351±0.117&& 0.195±0.147* 0.210±0.128* 0.390±0.106## 0.095±0.051

3 讨论

急性脑缺血再灌注损伤是一个复杂的生理病理过程，涉及能量代谢障碍、局部酸中毒、炎症因子释放、自由基损伤、细胞凋亡等方面［11］，其中海马区细胞凋亡起着重要的作用。本文采用改良线栓法复制急性局灶性脑缺血再灌注损伤模型，发现脑缺血再灌注损伤大鼠海马CAl区神经细胞排列紊乱、细胞皱缩，体积缩小，与周围细胞分离，嗜酸性变及凋亡，这与文献报道一致［12］，提示HSYA与芍药苷联合用药对急性脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织病理损伤具有明显的保护作用，且优于二者单独给药，说明两者具有协同作用。

脑缺血再灌注损伤发生后，从损伤机制上看临床上改善损伤的药物主要为抗血小板聚集、神经保护剂、抗氧化剂等药物。脑血栓的形成是急性脑梗死常见病因［13］，缺血后的炎症反应可导致神经功能缺失，因此利用抗血小板药物抑制血小板激活，不仅可以预防血栓的形成，还可以减轻由血小板激活而诱发的炎症反应［14］；CD62P是目前所知的反映血小板活化与释放最特异性的标志物［15］，CD62P的表达在促使梗死形成及血小板激活中起着关键性作用，CD62P的表达量与神经功能缺损程度呈正相关，脑卒中病情好转时CD62P的表达量减少甚至不表达，反之亦然［16］。有报导脑梗死时血浆中CD62P的表达先升后降，但7 d后仍高于正常水平［17-18］，因此通过对CD62P活化程度的检测不仅可以判断脑梗死预后程度，而且还可以同时指导治疗。本文研究发现，连续给药7天后，模型组全血中CD62P的活化程度较假手术组高，表明大鼠体内尚有炎症反应及血小板活化，而HSYA组和合用组对CD62P活化具有明显的抑制作用，且合用组与HYSA组比较无明显差别，但与芍药苷相比有明显的抑制作用，提示抗血小板是HSYA的主要作用［19］，HSYA与芍药苷联用对CD62P的抑制作用亦优于芍药苷单独用药。

综上所述，HSYA、芍药苷对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用各有其侧重点，但二者联合用药却具有优势互补的作用，HSYA与芍药苷联合用药对脑缺血再灌注损伤的作用优于二者单独用药，其联合用药可能与抑制CD62P的表达有关。

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【责任编辑：邓军文 dengjunwen69@126.com】

Effect of HSYA combined with paeoniflorin on hippocampus brain tissue and the expressionof CD62P with cerebral ischemia reperfusion injury in rats

WU Li-cai1,YU Meng-li2,LIAO Jin-ming3,XU Yu-lin2,ZHENG LI-xian3, YAO Hui4,QIN Sha-sha5,ZHANG Ji-ping4

（1.Shunde Hospital,Southern MedicalUniversity,Foshan 528300,China;2.SchoolofPharmacy,GuangdongMedicalUniversity, Zhanjiang524023,China;3.Collegeof TraditionalChineseMedicine,Southern MedicalUniversity,Guangzhou 510515,China; 4.Affiliated Foshan Hospital,Southern MedicalUniversity,Foshan 528000,China;5.Schoolof TraditionalChineseMedicine, Guangdong PharmaceuticalUniversity,Guangzhou 510006,China）

Objective To investigate the effects of HSYA combined with paeoniflorin on brain tissue and the expression of plateletactivation in ratmodelswith cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Male SPF of SD ratswere randomly divided into HSYA group(5mg·kg-1),paeoniflorin group(5mg·kg-1),combination group HSYA and paeoniflorin(combination group)(5mg·kg-1)and ginkgolidegroup(5mg·kg-1),modelgroup and the sham operation group.The ratmodel ofmiddle cerebral artery occlusion (MCAO)was induced bymodified suturemethod.After 1 h of cerebral ischemia followed by 6 h reperfusion,rats tail intravenous injection for 7 days,to collectand preserve the corresponding index after the lastadministration of2 h;hematoxylin eosin(HE) stainingwasused to observe themorphologicalchangesofnerve cells in the hippocampus;flow cytometry(FCM) assaywasused to observe the P-selectin(CD62P)content in blood.Results The resultsofHE staining showed thatcompared with themodelgroup,HSYA,paeoniflorin and the combination group could obviously improve the damage degree of the neurons in the hippocampus of ratswith acute cerebral ischemia and reperfusion.FCM results showed that compared with sham operation group,the activation degree of CD62P was significantly increased in model group(p＜0.01);compared with the model group,combination group and the degree of activation ofginkgolide groups could significantly inhibit thewhole blood CD62P (p＜0.05);compared with the combined group,the activation degree of CD62P significantly increased in paeoniflorin group(p＜0.01),but between the HSYA group and the combination group had no significant difference inhibition.Conclusion The protectivemechanism ofHSYA combined with paeoniflorin on hippocampalneuronsmay be related to inhibition ofCD62Pexpression on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

HSYA;paeoniflorin;plateletactivation

TS251.1

A

2017-05-12

佛山市科技攻关项目（2016AB002981）；广东省中医药局课题（20162145）；佛山市十三五重点专科项目（FSZDZ K135025）

吴丽彩（1975-），女，广东顺德人，南方医科大学顺德医院主管药师。

*通信作者：秦莎莎（1989-），女，湖北襄阳人，广东药科大学2014级硕士研究生。张继平（1964-），男，重庆人，南方医科大学附属佛山医院研究员。

1008-0171（2017）04-0085-04