红景天苷对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠RhoA/Rho激酶信号通路的影响*

薛运昕,宁 欣,郭天聪,倪 楠,蔡昕姝

辽宁省金秋医院呼吸科(沈阳 110016)

红景天苷对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠RhoA/Rho激酶信号通路的影响*

薛运昕,宁 欣,郭天聪,倪 楠,蔡昕姝

辽宁省金秋医院呼吸科(沈阳 110016)

目的：探讨红景天苷对肺动脉高压大鼠的肺组织病理与RhoA/Rho激酶信号通路的影响。方法：将30只6～8周龄雄性SD大鼠随机分为五组：正常对照组、模型对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组；除正常对照组注射对照溶剂外，其余组皮下注射60 mg/kg野百合碱，2～28 d后，对低、中、高浓度组分别注射50、100、200 mg/(kg·d)红景天苷，对照组注射生理盐水；实验结束，分别检测各组右心室收缩压(RVSP)及右心室肥厚指数；HE染色检测大鼠肺组织病理变化，RT-PCR检测肺组织ROCK1 、RhoA mRNA表达水平，Western blot检测肺组织RhoA、ROCK1、p-MYPT1蛋白表达及磷酸化水平。结果：与正常对照组比较，模型对照组RVSP及右心室肥厚指数显著上升，肺组织RhoA 、ROCK1 mRNA显著上调，ROCK1、RhoA、p-MYPT1蛋白表达及磷酸化水平显著上调；不同浓度红景天苷干预后，各组RVSP及右心室肥厚指数出现变化，高浓度组显著下调；肺组织RhoA 、ROCK1 mRNA逐渐下调，RhoA、ROCK1、p-MYPT1蛋白表达及磷酸化水平逐渐下调，呈浓度依赖，中、高浓度组变化显著。结论：一定剂量红景天苷能够缓解野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，可能与其对RhoA/Rho激酶信号通路抑制有关。

肺动脉高压(Pulmonary artery hypertension，PAH)是一类由于肺动脉血压升高、肺血管重塑引起的以右心室肥大、右心功能不全为特征的疾病，发病机制尚未完全阐明[1]。研究发现RhoA/Rho激酶信号通路介导的各种细胞功能可能参与PAH的形成及发生发展各阶段[2-4]。中药红景天具有保护神经及心血管系统、调节机体代谢，延缓衰老等重要作用，在PAH的临床应用已经开展初步研究，但是对于相关分子机制的探讨还很少见[5-6]。本实验将以野百合碱诱导的PAH大鼠为模型，探讨其主要活性成分红景天苷(Salidroside，Sal)对大鼠肺组织病理与肺动脉重构的影响，以及RhoA/Rho激酶信号通路在其中的可能调节作用。

材料及方法

1 主要材料及试剂 雄性SD大鼠，6～8周龄；野百合碱、红景天苷均购自大连美仑；M-MLV反转录酶、高纯总RNA快速提取试剂盒购自Bioteke(北京)；ROCK1、β-actin多克隆兔抗抗体购自万类生物(沈阳)，RhoA、p-MYPT1多克隆兔抗抗体购自Bioss(北京)；辣根过氧化物酶HRP标记羊抗兔二抗购自碧云天(海门)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自万类生物(沈阳)；生物机能实验系统(成都)。

2 动物建模及分组 选取6～8周龄、健康SD大鼠30只，随机分为正常对照组，模型对照组，低浓度组、中浓度组、高浓度组；模型及药物处理组大鼠皮下注射60 mg/kg 野百合碱(600mg野百合碱溶于4ml无水乙醇与生理盐水混合物中，无水乙醇∶生理盐水=2∶8)，正常对照注射等量溶剂(无水乙醇∶生理盐水=2∶8)。第2～28天腹腔注射低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)浓度红景天苷干预，其他组注射等体积生理盐水。第28天，检测大鼠各项指标，处死所有大鼠并取材，部分固定于4%多聚甲醛溶液中，部分液氮速冻转至-70℃冰箱中保存。

3 血流动力学指标检测 将各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉，仰卧位固定于手术台上，颈部去毛消毒，手术剪剪开皮肤，分离右侧颈外静脉，经颈外静脉插管至右心室，接压力换能器连接生物机能实验系统，记录大鼠右心室收缩压(RVSP)。

4 组织病理学观察 大鼠测压后处死，开胸取心脏，去除左右心房及大血管，分离右心室游离壁组织(RV)及左心室+室间隔组织(LV+S)，冲洗去除残留血液，滤纸吸净表面水分，称重并计算右心室肥厚指数(RV/(LV+S))；分离气管并结扎左肺叶，多聚甲醛灌注右肺进行固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，观察细小动脉病理改变。

5 RT-PCR检测大鼠肺组织RhoA 、ROCK1 mRNA表达 收集各组大鼠肺组织样本，利用总RNA提取试剂盒提取大鼠肺组织RNA，经M-MLV逆转录酶反应合成cDNA第一链，加入相应检测引物进行PCR检测肺组织RhoA 、ROCK1基因mRNA表达水平，根据NCBI数据库提供的目标基因序列信息，RhoA上游引物序列：5’- TCGGAATGATGAGCACACAA -3’；下游引物序列： 5’- GCTTCACAAGAT AGGCAC -3’；ROCK1上游引物序列：5’- GATGGCTATTATGGACGAG -3’；下游引物序列：5’- TCTGCCCAATCTCACTTC -3’；内参为β-actin上游引物序列： 5’- GGAGATTACTGCCCTGGC CCTAGC -3’；下游引物序列 ： 5’GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT -3’；PCR反应条件如下：95℃，预变性5min；95 ，变性30 s；56℃，退火30 s；72℃，延伸30 s；循环数30。对所获得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析扫描光密度数值，计算ROCK1 、RhoA的相对表达量。

6 Western blot检测大鼠肺组织ROCK1、RhoA、p-MYPT1蛋白表达及磷酸化水平 对各组大鼠肺组织样本利用RIPA裂解液匀浆裂解，提取蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量，并调整蛋白浓度，每组样本以20 μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转法低温转印，一抗(ROCK1、RhoA、p-MYPT1均1∶500稀释)4℃孵育过夜，经TBST洗涤3次，加入HRP标记羊抗兔二抗(1∶5000稀释)于37 ℃孵育45 min，经TBST洗涤3次，洒入ECL发光液适量，反应约5 min，放于暗室中对胶片进行曝光、显影、定影，扫描胶片采集灰度值，以β-actin做为内参进行校正，以正常对照组条带灰度值为1，其他组别条带灰度值与之进行比较，所得数值即为目标蛋白相对表达量。

结 果

1 右心室收缩压(RVSP)及右心室肥厚指数变化 与正常对照组比较，造模28 d后，模型对照组RVSP明显上升(P<0.05)，提示造模成功；给予红景天苷干预后，中、低浓度组大鼠RVSP变化无统计学差异，但高浓度组降低程度显著，与模型组比较存在统计学意义(P<0.05)；正常对照组及模型对照组大鼠RV/(LV+S)比较，存在统计学差异(P<0.05)，不同浓度梯度红景天苷干预后，中、低浓度组大鼠RV/(LV+S)变化无统计学差异，但高浓度组降低程度显著，与模型组比较具有统计学差异(P<0.05)，见表1。

2 大鼠肺组织病理学变化 正常对照组大鼠肺组织部位细小肺动脉内膜结构完整，平滑肌层细胞无增厚现象，细胞与胞核排列比较规整，未出现炎症细胞浸润；而模型对照组大鼠肺组织血管周围出现大量淋巴细胞与中性粒细胞，存在明显炎性细胞浸润现象，平滑肌全层增厚，细胞排列较为紊乱；在不同浓度梯度的红景天苷药物干预后，各组大鼠肺组织炎性细胞浸润有所减轻，肺细小血管重塑情况得到改善，其中以高浓度组变化最为明显(图1)。

表1 各组大鼠血流动力学及病理学指标比较±s)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05

A：正常对照组；B：模型对照组；C：低浓度组；D：中浓度组；E：高浓度组

3 RT-PCR检测肺组织ROCK1 、RhoA mRNA表达 与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织ROCK1 、RhoA mRNA表达水平显著上调(P<0.05)；不同浓度梯度红景天苷干预后，各组大鼠肺组织ROCK1 、RhoA mRNA表达水平逐渐降低，呈浓度梯度依赖，中、高浓度组与模型对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。

4 Western blot检测肺组织ROCK1、RhoA蛋白表达及MYPT1磷酸化 与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织中ROCK1、RhoA表达及MYPT1磷酸化显著上调(P<0.05)；不同浓度梯度红景天苷干预后，各组大鼠肺组织中ROCK1、RhoA表达及MYPT1磷酸化水平逐渐下降，呈浓度梯度依赖，与模型对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。

A：肺组织ROCK1、RhoA mRNA表达；B：肺组织ROCK1 、RhoA mRNA相对表达量；与正常对照组，*P<0.05；与模型对照组，△P<0.05

图2 肺组织ROCK1 、RhoA mRNA表达情况

A：肺组织ROCK1 、RhoA蛋白表达及MYPT1磷酸化情况；B：肺组织ROCK1 、RhoA蛋白表达及MYPT1磷酸化相对量

图3 肺组织ROCK1、RhoA蛋白表达及MYPT1磷酸化情况(与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05)

讨 论

Rho属于小G蛋白家族，通过激活下游Rho激酶蛋白调节细胞黏附、迁移、增殖、凋亡等多种生物学行为[7]。Rho激酶(ROCK)包括ROCK1及ROCK2两种异构体，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是RhoA的下游效应分子，接收RhoA介导的活化信号，调控下游一系列信号传递，调节细胞多种生物学功能[8]。血管平滑肌细胞的正常功能保证了血管的收缩平衡。RhoA-Rho激酶信号通路对血管平滑肌细胞的收缩具有重要的调节作用，该信号的异常激活与多种血管疾病存在密切联系[9]。

最近研究发现，RhoA-Rho激酶信号通路参与了PAH的形成。Abe[10]等报道，作为选择性Rho激酶抑制剂，Y-27632或法舒地尔能够显著降低PAH模型大鼠的血管持续性收缩反应以及血管重建，抑制野百合碱介导的PAH大鼠肺血管平滑肌细胞增殖并诱导细胞凋亡。Xu[11]等也发现Y-27632能够显著降低低氧引起的新生小鼠右心室肥厚，逆转动脉血管壁重建。Tawara S等报道了Rho激酶抑制剂与前列腺环素联用有利于改善野百合碱介导的PAH大鼠右心室肥大以及肺血管中层增厚[12]。本实验发现，经过野百合碱刺激后，由于肺动脉压力增加及肺血管重构，模型对照组大鼠肺组织中RhoA蛋白表达水平上调，Rho激酶(ROCK1)表达上升，Rho激酶调节亚单位(MYPT-1)磷酸化水平增加，提示Rho激酶在大鼠PAH模型中活性增强，RhoA-Rho激酶通路可能参与了PAH的发生以及肺血管的重构，与文献中报道一致。红景天苷是藏药红景天中提取的苯乙醇类化合物，也是发挥主要作用的有效成分，具有保护心脑血管系统、抗疲劳、抗肿瘤等多重药理作用，具有较为广泛的应用前景[13]。本实验中，对野百合碱处理的大鼠给予红景天苷干预后，随着药物浓度增加，与模型对照组大鼠比较，高浓度药物干预组大鼠RVSP及右心室肥厚指数存在显著降低，具有统计学差异；大鼠肺组织炎性细胞浸润程度逐渐减弱，肺细小血管重塑情况得到改善，与药物浓度呈正相关；红景天苷的上述效应可能与多种信号通路有关。本实验中通过RT-PCR及蛋白免疫印迹实验检测发现药物处理组大鼠肺组织RhoA、ROCK1 mRNA及蛋白表达水平逐渐降低，p-MRPT1水平逐渐降低，呈浓度梯度依赖。

本论文研究证明，红景天苷对野百合碱所致PAH大鼠模型具有一定治疗作用，可能与其抑制RhoA、ROCK表达水平，抑制RhoA/ROCK激酶通路的激活而逆转PAH以及肺血管重构有关，红景天苷有可能为延缓肺动脉高压进展提供一种新的选择。

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(收稿：2016-08-18)

Effect of Salidroside on the signal pathway of RhoA/Rho kinase in monocrotaline -induced pulmonary hypertension in rats

Xue Yunxin，Ning Xin,Guo Tiancong,et al.

Jinqiu Hospital of Liaoning Province(Shenyang 110016)

Objective: To investigate the effect of salidroside on RhoA/Rho kinase signaling pathway on lung tissue pathology in rats with pulmonary hypertension.Methods: The thirty 6-8 week old male SD rats were randomly divided to 5 groups: normal control group, model control group, low concentration group, middle concentration group, the high concentration group. In addition to the normal control group, the other groups were injected with 60 mg/kg of monocrotaline. in 2-28 day, the rats in low concentration group, medium concentration group and high concentration group were injected with salidroside at 50, 100, 200 mg/kg/d, respectively, the control group rats were injected with normal saline. At the end of the experiment, the right ventricular systolic pressure (RVSP) and the right ventricular hypertrophy index were detected in each group. The pathological changes of lung tissue were detected by HE staining in rats. The mRNA expression level of ROCK1 and RhoA in lung tissue was detected by RT-PCR. The protein expression level of ROCK1,RhoA and and phosphorylation of MYPT1 in lung tissue was detected by Western blot. Results: Compared with the normal control group, in model control group rats,the RVSP and right ventricular hypertrophy index increased significantly, the RhoA and Rock1 mRNA in lung tissue was significantly up-regulated, the protein expression of RhoA,Rock1, and p-MYPT1 were significantly up-regulated. After treatment with different concentrations of salidroside, the changes of RVSP and right ventricular hypertrophy index were significantly lower in the high concentration group. The expression of RhoA and ROCK1 mRNA in lung tissue was gradually down regulated, and the expression and phosphorylation of RhoA,ROCK1, p-MYPT1 were gradually down regulated, which was concentration dependent, and the change of medium and high concentration groups was significant.Conclusion: A certain dose of salidroside can alleviate the pulmonary hypertension induced by monocrotaline, which may be related to the inhibition of the RhoA/Rho kinase signaling pathway.

@Pulmonary artery hypertension Salidroside Rhodioloside/pharmacology @RhoA/Rho kinase Monocrotaline Rats

*辽宁省直医院改革重点临床科室诊疗能力建设项目青年项目(LNCCC-D37-2015)

@肺动脉高压 红景天苷/药理学 @RhoA/Rho激酶 野百合碱 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.004