乳浆大戟抑制原代人胃癌多药耐药细胞增殖和诱导凋亡研究*

米志宽，符兆英，王爱红 ，王 磊，李 飞，郑 军，雷 星，任清泉

1.延安大学医学院(延安 716000)， 2. 延安大学附属医院(延安 716000)

乳浆大戟抑制原代人胃癌多药耐药细胞增殖和诱导凋亡研究*

米志宽1，符兆英1，王爱红1△，王 磊2，李 飞2，郑 军2，雷 星2，任清泉2

1.延安大学医学院(延安 716000)， 2. 延安大学附属医院(延安 716000)

目的：研究乳浆大戟抑制原代培养多药耐药人胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。方法：制备人胃癌多药耐药原代培养细胞，用不同稀释度的乳浆大戟提取液处理人胃癌多药耐药原代培养细胞，MTT实验观察细胞生长抑制现象，吖啶橙染色荧光显微镜观察凋亡细胞的核形态改变并测定凋亡指数，流式细胞术检测细胞凋亡率；以不加乳浆大戟提取液的细胞作对照。结果：乳浆大戟对人胃癌多药耐药原代培养细胞有增殖抑制作用，该作用有时间和浓度依赖性。乳浆大戟处理后的人胃癌多药耐药原代培养细胞，荧光显微镜下观察可见细胞核固缩、染色不均匀和核碎片等细胞凋亡的形态学改变，凋亡形态显示的凋亡指数和流式细胞术显示的凋亡率均明显上升，均有时间和浓度依赖性；以上作用与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论：乳浆大戟提取液具有抑制人胃癌多药耐药原代培养细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。

胃癌(Gastric cancer)是中国常见的恶性肿瘤之一，分别居我国农村和城市恶性肿瘤发病率的第一位和第二位[1-3]。早期胃癌以手术治疗为主，中晚期则以化疗为主要治疗手段。但由于肿瘤细胞往往对化疗药物产生多药耐药性(Multidrug resistance, MDR)，而使得疗效不佳[4-6]。本文研究了乳浆大戟(Euphorbia esula Linn)抑制人胃癌多药耐药原代培养细胞增殖和诱导人胃癌多药耐药原代培养细胞凋亡的作用，旨在寻找一种对抗或逆转人胃癌多药耐药的中药材。

材料与方法

1 实验材料 RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清(FBS)和胰酶购自Gibco公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)购自Sigma公司，细胞培养板为丹麦Cyclone公司产品，流式细胞仪为美国贝克曼公司产品，荧光显微镜和倒置显微镜均为日本OLYMPUS产品。酶标检测仪为美国Bio-Rad产品。

2 人胃癌多药耐药原代培养细胞制备 取手术切除的多药耐药人胃癌组织新鲜标本，制备单细胞悬液，调整单细胞悬液至活细胞浓度为5×108/L，用含10% FBS的RPMI-1640培养液，加100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在37℃、5% CO2和饱和湿度的无菌条件下常规培养，加入终浓度为0.5μg/ml 的阿霉素以选择并维持耐药细胞；每2～3天更换新鲜培养液1次；细胞生长接近铺满瓶底时进行传代培养；取处于指数生长期的细胞用于实验。

3 细胞生长抑制实验 将乳浆大戟原液用含10% FBS的RPMI-1640细胞培养液稀释成不同稀释度：20、40、 80 、 160 、 320、 640 μg/ml。取对数生长期的多药耐药人胃癌原代培养细胞，用0.25%胰酶消化，用含10% FBS 的RPMI-1640培养液制成浓度为1×104/ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔0.1 ml，37℃、5% CO2培养24 h。观察细胞生长良好，弃去旧培养液，将不同浓度的乳浆大戟稀释液按每孔0.2 ml加入培养孔，每个浓度设6个复孔，并设正常细胞对照(不加乳浆大戟的细胞孔，每孔加0.2 ml 10% FBS RPMI-1640细胞培养液)，在37℃、5% CO2和饱和湿度条件下培养。

培养24 h和48 h后的细胞，分别加入5% MTT溶液20μl/孔，终浓度5mg/ml，置37℃、5% CO2培养箱继续培养4 h，弃去各细胞孔的上清液，每孔加入100 μl DMSO，缓慢振荡10 min，使结晶充分溶解，用酶标检测仪在570 nm波长处读取A值。以只含10% FBS 的RPMI-1640细胞培养液的孔调零，取6个复孔的算术平均值，按以下公式计算细胞生长抑制率：抑制率%=(正常细胞对照孔的平均A值-乳浆大戟处理孔的平均A值)/正常细胞对照孔的平均A值×100%。

4 吖啶橙染色测定凋亡指数 将人胃癌原代培养细胞在10% FBS的RPMI-1640培养液中37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下常规培养。对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于6孔细胞培养板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培养24 h后，弃去原培养液，加入用10% FBS RPMI-1640细胞培养基稀释的不同浓度的乳浆大戟稀释液：40、80、160 μg/ml，每孔4 ml，并设立不含乳浆大戟的对照组。37℃、5% CO2、饱和湿度培养24、48 h和72 h后分别收获细胞。将细胞以1%福尔马林固定，用吖啶橙染色，荧光显微镜高倍镜下观察细胞形态并计数凋亡细胞。细胞体积缩小、细胞核浓染、固缩和染色体边缘化者为凋亡细胞。随机取5个视野，每个视野计数400个细胞，记录其中的凋亡细胞数。按以下公式计算凋亡指数：凋亡指数=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

5 流式细胞术检测细胞凋亡率 对数生长期的人胃癌多药耐药细胞原代培养，用0.25%的胰酶消化，制备单细胞悬液，用含10% FBS 的RPMI-1640培养液配成1×104/ml浓度，接种于6孔细胞培养板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培养24 h后，弃去原培养液，加入用10% FBS RPMI-1640细胞培养基稀释的不同浓度的乳浆大戟稀释液：40、 80、 160 μg/ml，每孔4 ml，并设立不含乳浆大戟的对照组。继续培养24 h、48 h和72 h后，每个浓度和未加乳浆大戟的对照分别收集106个细胞，1000 r/min离心7 min，弃上清，用PBS洗2遍。加入500 μl 4℃预冷的70%乙醇在4℃固定1 h，1000 r/min离心7 min，弃上清，用PBS洗2遍，3 ml PBS重悬细胞。每管加入PI溶液1 ml，充分混匀，避光室温静置30 min后，上流式细胞仪检测，取3次的平均值计算细胞凋亡率。

结 果

1 MTT实验显示的乳浆大戟对多药耐药人胃癌原代培养细胞的增殖抑制作用 不同浓度的乳浆大戟稀释液处理人胃癌多药耐药细胞原代培养后，MTT检测结果显示，乳浆大戟稀释液明显地抑制了多药耐药人胃癌原代培养细胞的增殖活性，而且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用呈现逐渐增强的趋势，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 乳浆大戟对多药耐药人胃癌原代培养细胞增殖活力抑制作用的MTT检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与前一浓度比较，△P<0.05；与24 h抑制率比较，▲P<0.05

2 凋亡形态显示的乳浆大戟诱导多药耐药人胃癌原代培养细胞凋亡指数升高的情况 乳浆大戟稀释液处理后的人胃癌多药耐药原代培养细胞，经吖啶橙染色，荧光显微镜下观察凋亡形态，可见细胞核固缩、染色不均匀、边缘化和核碎片、以及荧光增强等细胞凋亡变化的形态学改变，计数凋亡细胞和计算凋亡指数的结果显示，乳浆大戟诱导多药耐药人胃癌原代培养细胞的凋亡指数随药物浓度的增加和作用时间的延长而呈现明显的升高趋势，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 乳浆大戟处理多药耐药人胃癌原代培养细胞后的凋亡指数±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.01

3 流式细胞术检测显示的乳浆大戟诱导多药耐药人胃癌细胞凋亡率上升的情况 人胃癌多药耐药原代培养细胞经梯度浓度的乳浆大戟稀释液处理24 h、48 h和72 h后，作流式细胞仪检测凋亡情况，可见各药物浓度组诱导人胃癌原代培养细胞的凋亡率与未加药对照组之间差异显著，细胞凋亡率随药物浓度的增加和药物作用时间的延长而升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表3。

表3 乳浆大戟处理多药耐药人胃癌原代培养细胞流式细胞仪检测的凋亡率±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.01

讨 论

肿瘤的发生是由细胞增殖和细胞凋亡失去平衡所导致；抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，是抗肿瘤治疗的的一个重要研究领域和很有希望的研究领域。用中药抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡是多年来和近年来国内抗肿瘤研究的热点之一[7-8]。细胞凋亡在胃癌的发生和发展中起着非常重要的作用，化学药物虽可诱导胃癌细胞凋亡，但容易出现多药耐药，并且不良反应较重。

肿瘤多药耐药指肿瘤细胞一旦对一种化疗药产生耐药，就会对多种化疗药产生交叉耐药性。研究发现，肿瘤耐药有多种机制，包括细胞膜P-糖蛋白过度表达使药物外排增加、药物在细胞内的灭活降解增加、抑制细胞凋亡、减弱化疗药物的毒性、降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等[9-13]。肿瘤多药耐药研究在多年来一直被重视，逆转肿瘤多药耐药目前仍然是国内外抗肿瘤研究的一个热点。中药毒副作用小，易被患者接受，在逆转肿瘤多药耐药上具有一些优势[14-15]。比西药在治疗多药耐药胃癌方面更具有潜在的前景。

乳浆大戟(英文名称Leafy Spurge)在多种植物类书籍和中药材书籍中均有记载[16-17]，是大戟科大戟属的一种植物。根据中国植物志[16]，乳浆大戟又称猫眼草、乳浆草和华北大戟等。乳浆大戟是一种多年生草本植物，根圆柱状，20 cm以上长，直径约4mm，褐色或黑褐色。茎单生或丛生，30～60 cm高，主干直径约4mm。叶长2～7 cm，宽4～7mm，线形，先端尖，基部楔形，无叶柄。雄花多枚，苞片宽线形；雌花1枚，子房柄明显伸出总苞之外。蒴果三棱状球形，直径5～6mm。种子卵球状，长约3mm，直径约2mm，成熟时黄褐色。乳浆大戟分布于全国大部分地区，在陕北地区比较多见。乳浆大戟地上全草可作为药用，味苦辛、性微寒、有毒，归胃、肝、脾、肺经，有散结、拔毒、逐水、消肿、祛痰、镇咳之功效具拔毒止痒之效[17]。

已发现乳浆大戟提取物具有抑制体外培养的恶性肿瘤传代细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用[3,18-20]。本实验中，我们研究了乳浆大戟对多药耐药人胃癌原代培养细胞增殖和凋亡的作用：用MTT实验研究了乳浆大戟对人胃癌原代培养细胞的增殖抑制或细胞毒作用、用吖啶橙染色荧光显微镜凋亡细胞核形态观察研究了乳浆大戟对人胃癌原代培养细胞凋亡指数的影响，用流式细胞术研究了乳浆大戟诱导人胃癌原代培养细胞凋亡的凋亡率。研究结果发现，乳浆大戟具有明显的抑制多药耐药人胃癌原代培养细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，该研究为利用乳浆大戟逆转人胃癌多药耐药或进行胃癌辅助治疗打下了一定的基础。

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(收稿：2016-10-18)

Euphorbia esula inhibition of primary culture multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce the apoptosis of research

Mi Zhikuan, Fu Zhaoying, Wang Aihong, et al.

Yan’an University Medical College(Yan’an 716000)

Objective: To study the Euphorbia esula by inhibiting the generation of cultivating multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce cell apoptosis. Methods: For the preparation of human gastric cancer multi-resistant primary cells, diluted with different degrees of Euphorbia esula extract processing people primitive culture cell, stomach multi-resistant determined by MTT experiment to observe the cell growth inhibition phenomenon, acridine orange staining fluorescence microscope determination of observing the nuclear morphological changes of apoptotic cells and apoptotic index, rate of flow cytometry to detect cell apoptosis. Results: Euphorbia esula on gastric cancer multi-resistant primitive culture cell proliferation inhibition, which had the time and the concentration dependence. Euphorbia esula multi-drug resistance of cancer of the stomach after processing the original generation of cultured cells, apoptosis index and apoptosis rate of rise, had the time and the concentration dependence. The above changes were statistically significant (P<0.05,P<0.01). Conclusions: Euphorbia esula extract could inhibit people primitive cultivating multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce cell apoptosis.

Stomach neoplasms/pathology @Euphorbia esula Drug tolerance Apoptosis Drug resistance,multiple Cell prliferation Primary cell cultare

*陕西省延安市科技项目(2014HM-05)

胃肿瘤/病理学 @乳浆大戟 药物耐受性 细胞凋亡 抗药性，多药 细胞增殖 原代细胞培养

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.006

△通讯作者