松仁粕中清蛋白的提取工艺及功能性质研究

赵楠，阮俊青，包怡红

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

松仁粕中清蛋白的提取工艺及功能性质研究

赵楠，阮俊青，包怡红*

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

以脱脂松仁粕为材料，清蛋白提取率为考察指标，蒸馏水为提取剂，设料(质量，g)液(体积，mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取温度(35、40、45、50、55 ℃)和提取时间(30、60、90、120、150 min)3个单因素试验，在单因素试验的基础上采用响应面法优化清蛋白的提取工艺，并对清蛋白的功能性质进行研究。结果表明：松仁粕中清蛋白的最佳提取工艺为料液比 1∶25、提取时间 92 min、提取温度 53 ℃，松仁粕中清蛋白的提取率可达 23.52%；松仁粕清蛋白的溶解度在 pH值为3时最小，在碱性条件下具有较好的溶解性、起泡性与乳化性。

松仁粕；清蛋白；响应面法优化；提取工艺；功能性质

红松(Pinus konaiensis Sieb. et Zucc.)为松科松属植物，是常绿针叶乔木，主要分布于黑龙江省小兴安岭和吉林省长白山一带[1-2]。红松的种子略扁，呈圆锥形状。松仁营养丰富，含有蛋白质、碳水化合物、脂肪、微量元素等多种人类所需的基本营养物质[3-5]，有“长寿果”之称。松仁粕是松仁油生产过程中的副产物，不仅产量高，还含有丰富的蛋白质、膳食纤维及微量元素等，有较大的再利用价值。笔者以松仁粕为原料，探索其清蛋白的提取工艺参数和功能性质，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

供试松仁粕购自七台河市宏泰松果有限公司；硫酸铜、浓硫酸、溴甲酚绿、硫酸钾、甲基红等均为分析纯；考马斯亮蓝 G-250、牛血清蛋白购自北京博奥拓达科技有限公司。

分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；恒温水浴振荡器，上海百典仪器设备有限公司产品；粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；离心机，上海安亭科学仪器厂产品；FA25高剪切分散乳化机，山海弗鲁克流体机械制造有限公司产品；722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 脱脂松粕的制备

取松仁粕，用粉碎机粉碎，过孔径为0.425 mm筛，以石油醚为溶剂，按料(质量，g)液(体积，mL)比1∶10进行脱脂，干燥，得松仁粕粉，备用。

1.2.2 松仁粕清蛋白的提取工艺流程

松仁粕→过筛→脱脂→恒温振荡提取→离心→过滤→二次浸提沉淀→离心→过滤→合并松仁粕清蛋白提取液→调至等电点→干燥。

1.2.3 清蛋白提取率的测定

参照GB/T 5009.5—2010的方法测定松仁粕中的总蛋白含量；采用考马斯亮蓝法测定提取液中松仁粕清蛋白含量。

标准曲线的建立：精确吸取0.1 mg/mL牛血清蛋白标准液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，分别加入 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL蒸馏水，摇匀，加入5 mL考马斯亮蓝显色剂，室温下反应，稳定 5 min 后，在 595 nm下测定其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，作标准曲线，得到回归方程 y=7.113 3x+0.142 3，R2=0.999 2。

1.2.4 单因素试验设计

以蒸馏水为提取剂(pH=6.2)，参照1.3.2中工艺提取松仁粕清蛋白，选择料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，提取温度 35、40、45、50、55 ℃和提取时间30、60、90、120、150 min进行单因素试验。

1.2.5 响应面法优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，结合单因素试验结果，进行3因素3水平试验(表1)。

表1 响应面试验的因素和水平Table 1 Experimental design of response surface methodology

1.2.6 验证试验

以松仁粕粉末为材料，按照最佳提取工艺进行试验，测定松仁粕中清蛋白的提取率。

1.2.7 松仁粕清蛋白功能性质的测定

1) 松仁粕中清蛋白溶解性的测定。根据CHATTERJEE等[6]的方法略有修改。将清蛋白配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，分别调至不同 pH测定松仁粕清蛋白的溶解性。

2) 松仁粕清蛋白起泡性的测定。根据JAMDAR等[7]的方法略作修改。将清蛋白配成质量分数为1%的溶液，在不同 pH 下测定松仁粕清蛋白的起泡性及起泡稳定性。

3) 松仁粕清蛋白乳化性的测定。根据AMZA等[8]的方法测定。将清蛋白配制成质量分数为0.5% 的溶液，在不同 pH 下测定松仁粕清蛋白的乳化性及乳化稳定性。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 21.0软件进行数据处理与回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

当料液比分别为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 时，清蛋白的提取率相应为(7.84±0.3)%、(13.11±0.3)% 、 (14.82±0.4)% 、 (18.35±0.2)% 、(16.64±0.5)%，可见随着溶剂的增加，提取率呈先升高后降低趋势。当料液比为1∶25时，提取率最高，为 18.35%。当提取时间分别为 30、60、90、120、150 min 时，清蛋白提取率分别为(13.46±0.2)% 、 (15.14±0.2)% 、 (18.55±0.24)% 、(18.36±0.26)%、(16.6±0.32)%，随着时间的增加，清蛋白的提取率呈先升高后降低趋势。提取时间为90 min，清蛋白的提取率达到最大，为18.55%。当提取温度分别为 35、40、45、50、55 ℃时，清蛋白的提取率相应为(7.05±0.13)%、(10.41±0.46)%、(18.68±0.23)%、(20.77±0.5)%、(20.6±0.34)%，清蛋白的提取率呈先升高后降低趋势，温度为50℃时清蛋白的提取率达到最大，为20.77 %。

2.2 响应面试验结果

根据表 2 的结果，利用 Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行二次多元回归拟合，可得到松仁粕中清蛋白提取率(Y)和各个因子料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)之间的回归方程模型为：

表2 响应面优化试验结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

为验证方程的有效性，对此回归模型进行方差分析(表3)。由表 3 可知：P＜0.000 1，此模型为极显著(P＜0.01)；失拟项 P=0.502 9，不显著(P＞0.05)；R2=0.969 7，表明回归方程的实际值与预期值吻合度好，可以较好地描述各变量与响应值的关系。较低的离散系数(CV=5.13)进一步说明整个试验具有较好的精确度和可靠度。温度对松仁粕清蛋白提取率的影响最大，其次是时间，料液比的影响最小；模型中A2、B2、C2、C对松仁粕清蛋白提取率的影响极显著(P＜0.01)，A、B互作对松仁粕清蛋白的提取率的影响达显著水平(P＜0.05)。根据该回归方程绘制响应面图(图1)，得到最佳提取工艺：料液比为1∶25.16，提取时间为 91.53 min，提取温度为52.57 ℃。此条件下，松仁粕清蛋白的理论提取率为23.60%。

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the established regression model

图1 响应面交互作用下松仁粕清蛋白的提取率Fig.1 Yield of albumin response surface interaction

2.3 验证试验结果

根据优化的工艺参数，结合实际操作，将松仁粕清蛋白最佳提取工艺修正为料液比 1∶25，时间92 min，温度53 ℃。经3次平行试验，松仁粕清蛋白的提取率分别为 23.49%、23.65%、23.42%，平均提取率为23.52%，实际结果与模型结果吻合度良好，说明该模型可以较好地预测松仁粕清蛋白的提取率。

2.4 功能性质的测定结果

2.4.1 pH值对松仁粕清蛋白溶解性的影响

松仁粕清蛋白的溶解性试验结果表明，松仁粕清蛋白在 pH 值为1、3、5、7、9、11时的溶解度分别为(20.43±0.26)%、(3.37±0.30)%、(4.90± 0.36)%、(15.97±0.22)%、(78.28±0.26)%、(95.48± 0.26)%，清蛋白的溶解性在 pH 值为 3 时最小，之后随 pH值增大，松仁粕清蛋白的溶解性增大，表明松仁粕清蛋白在碱性条件下溶解性良好。

2.4.2 pH 值对松仁粕清蛋白起泡性的影响

如图2所示，在pH 值为3时，松仁粕清蛋白的起泡性与起泡稳定性均较差，之后随 pH 值的升高，清蛋白的起泡性与起泡稳定性增加，且泡沫细腻，表明松仁粕清蛋白在碱性条件下的起泡性和稳定性较好。

图2 不同pH值下松仁粕清蛋白起泡性及其稳定性Fig.2 The foaming capacity and stability of pine nut at different pH values

2.4.3 pH值对松仁粕清蛋白乳化性的影响

由图3可知，在 pH 值为3时，清蛋白的乳化性与乳化稳定性最差，分别为0.636 m2/g和39.33 min，pH ＞ 3 时，松仁粕清蛋白的乳化性与乳化稳定性都随 pH 值的增加而增加，在 pH值为 11.0时，松仁粕清蛋白乳化性与乳化稳定性最好，分别为34.32 m2/g和93.84 min。

图3 不同pH值下松仁粕清蛋白的乳化性及其稳定性Fig.3 The emulsification and stability of pine nut at dif ferent pH values

3 结论与讨论

本研究结果表明，当料液比为1∶25时，松仁粕清蛋白的提取率最高，随着溶剂的增加，提取率下降，可能是蛋白质分子与脱脂松仁粉颗粒的吸附作用大于蛋白质与水的扩散作用，导致松仁粕清蛋白的提取率下降[9-10]，这一结果与周立卿等[11]研究结果一致；松仁粕清蛋白的提取率随时间的延长不断增加，当时间大于 90 min 时提取率下降，是因为松仁粕清蛋白的溶出率达到饱和，水浴振荡会导致蛋白的变性，从而提取率会降低[12-13]，这与张贞亮[14]在不同时间内提取杏仁蛋白的结果一致；松仁粕清蛋白提取率也会随着温度的升高呈先升高后降低的趋势，可能是温度过高造成部分蛋白质变性所致[15-16]，这与洪晶等[17]的研究结果一致。

在松仁粕清蛋白功能性质的测定中，pH值为3时松仁粕清蛋白的溶解性最小，这可能是在等电点附近时，松仁粕清蛋白净电荷较少，随着 pH 的增加，松仁粕清蛋白的溶解性增加，当 pH 值大于3时，松仁粕清蛋白分子主要以负离子形式存在，随着pH的增加，松仁粕清蛋白表面带的负电荷就越多，排斥力增强，蛋白的溶解性也就增强，这与WU等[18]的研究结果一致；松仁粕清蛋白在碱性条件下的起泡性及其稳定性较好，可能是碱性条件下松仁粕清蛋白的溶解性增加，蛋白质的净电荷增加，松仁粕清蛋白在空气与水的表面能快速的展开并捕捉空气中的粒子，从而促进了泡沫的形成，这与邓芝串等[19]研究的黑籽瓜种子蛋白的起泡性与起泡稳定性的结果一致；松仁粕中清蛋白在碱性条件下的乳化性和乳化稳定性较好，是因为不在等电点时，蛋白分子所带的净电荷增加，静电斥力阻止油的聚集，同时松仁粕清蛋白的溶解度增加，使其向油和水界面扩散的能力增强，从而提高了乳化性。乳化活性指数的变化与蛋白质的溶解性的变化趋势是相似的，说明松仁粕清蛋白的乳化指数与松仁粕清蛋白的溶解性密切相关。这与史卿[20]研究富硒菜籽粕中蛋白的乳化性趋势一致。

综上所述，松仁粕中清蛋白较优提取工艺参数为料液比1∶25、提取时间 92 min、提取温度53 ℃，在此条件下，松仁粕中清蛋白的提取率为23.52%。松仁粕清蛋白的起泡性与乳化性均与松仁粕清蛋白的溶解性密切相关，在pH为3时松仁粕清蛋白的溶解性最差，在碱性条件下溶解性较好，起泡性与乳化性能也较好。

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责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

Study on extraction technology and functional properties of albumin in pine nut meal

ZHAO Nan, RUAN Junqing, BAO Yihong*
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The defatted pine nut meal was taken as the material and the distilled water as extraction agent. Three single factor tests of ratio of material to solvent(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30), extraction time( 30, 60, 90, 120, 150 min)and extraction temperature( 35, 40, 45, 50, 55 ℃)were conducted to detect the extraction efficiency of protein. On the basis of single factor tests, the extraction process parameters of albumin were optimized by response surface methodology, and the functional properties of albumin were studied. The results showed that the optimum extraction conditions of albumin in pine nut meal were as follows： the ratio of material to liquid was 1∶25, extraction time was 92 min, extraction temperature was 53 ℃, and the extraction rate of albumin was 23.52%. The solubility of albumin from pine nut meal was the smallest at pH 3.The albumin have good solubility, foaming and emulsifying properties under alkaline conditions.

pine nut; albumin; response surface optimization; extraction process; functional properties

TQ914.3

A

1007-1032(2017)04-0464-05

2016-08-30

2017-05-07

中央高校科研项目(2572014EA02，2572016AA39)；哈尔滨市科技创新人才项目(2015RAXXJ010)

赵楠(1991—)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事食品生物技术与功能食品研究，smyzhaonan@163.com；*通信作者，包怡红，教授，主要从事食品生物技术与功能食品研究，baoyihong@163.com