农田土壤中抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量检测方法的建立与应用

龚毅，杨丽华，彭晓春，龚道新*

(1.湖南农业大学农业环境保护研究所，湖南 长沙410128；2.环境保护部华南环境科学研究所，广东 广州 510655)

农田土壤中抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量检测方法的建立与应用

龚毅1,2，杨丽华1，彭晓春2*，龚道新1*

(1.湖南农业大学农业环境保护研究所，湖南 长沙410128；2.环境保护部华南环境科学研究所，广东 广州 510655)

为了探明抗倒酯及其代谢物抗倒酸在农田土壤中的残留消解规律，采用高效液相色谱检测技术(HPLC-UV)，通过添加回收试验法建立农田土壤中抗倒酯和抗倒酸残留量的检测方法。结果显示：用酸性乙腈振荡法提取农田土壤中残留的抗倒酯和抗倒酸，用氟罗里硅土分散固相萃取法净化提取液后进行HPLC-UV检测，当添加浓度为0.05、0.50、5.00 mg/kg时，抗倒酯的添加回收率为79.68%～103.55%，变异系数为1.26%～10.22%；抗倒酸的添加回收率为79.18%～104.13%，变异系数为3.29%～10.75%。结果表明该方法符合农药残留量分析与检测的技术要求。在此基础上，采用室内模拟试验研究20 ℃恒温和避光培养条件下抗倒酯和抗倒酸在2种湖南典型农田土壤(第四纪红土红壤和河潮土)中的残留消解情况，结果显示：抗倒酯和抗倒酸在2种供试农田土壤中的残留消解均符合一级化学反应动力学方程Ct=C0·e-kt，抗倒酯在第四纪红土红壤和在河潮土中的消解半衰期分别为8.92、7.67 d，抗倒酸的消解半衰期分别为9.39、8.59 d，表明抗倒酯和抗倒酸在2种供试农田土壤中的消解均较快，不易形成残留危害。

抗倒酯；抗倒酸；残留检测；消解动态；第四纪红土红壤；河潮土

作物倒伏，特别是禾本科作物水稻和小麦倒伏不仅会严重影响其产量和品质，而且会严重影响其顺利收获，更不利于机械化收获。抗倒酯(trinexapac-ethyl, 4-环丙基(羟基)亚甲基-3,5-二酮环己烷羧酸乙酯)为环己烷羧酸类植物生长调节剂，能够抑制植物体内赤霉素的后期生物合成，通过降低赤霉素的含量控制植物生长[1]。植株主要通过其茎、叶等绿色部分吸收抗倒酯，通过根系吸收的部分很少[2]。植物体内的抗倒酯可以在其生长部位发生作用，从而抑制植物细胞的伸长。抗倒酯具有效果稳定、毒性较小、价格低廉等优点，被广泛用于禾谷类、小麦、油菜和甘蔗等多种中国代表性经济作物的抗倒伏[1-2]。抗倒酯易在环境和生物体内代谢转化成为抗倒酸(Trinexapac)。抗倒酸与抗倒酯的功效相似[1]。欧盟和日本明确规定了抗倒酯的最大残留限量(以其代谢物抗倒酸(Trinexapac)计。在土壤中暂时还没有规定，一般也是以抗倒酸计)，规定小麦、大麦和黑麦的MRL值为0.5 mg/kg，其他粮谷的MRL值为0.6 mg/kg。目前，在农业生产中通常施用抗倒酯及其制品来防止作物倒伏，因此，研究抗倒酯及其代谢物抗倒酸在农田土壤中的残留水平和消解动态，对于保护农业生态环境具有重要意义。关于抗倒酯及其制品应用效果研究的报道较多[2-7]。目前，检测土壤中抗倒酯及其代谢物抗倒酸残留量的方法大多为高效液相色谱串联质谱法[8-13]。该方法对设备和技术的要求较高，实际操作难度较大。笔者建立了基于高效液相色谱仪的农田土壤中抗倒酯和抗倒酸残留量的分析与检测方法。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：Agilent Technologies 1260 Infinity(带紫外检测器和化学工作站，Agilent，美国)；SPH-21026振荡仪(昆山市超声仪器有限公司)；CCA-20低温冷却水循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；TP-220A电子天平(湘仪天平仪器设备有限公司)；FA2004N万分之一电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；XK80-A 快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)。

主要试剂：抗倒酯和抗倒酸标准品(纯度均为99.0%，由江苏优士化学有限公司提供，Dr.Ehrenstorfer，德国)；乙腈(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；甲醇(色谱纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；磷酸(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；水(纯净水，娃哈哈有限责任公司)；氟罗里硅土(Florisil，分析纯，60～100 mesh， ACROS ORGANICS，美国)。氟罗里硅土用前于550 ℃烘3～5 h，待冷却后以2%蒸馏水脱活，保持在130 ℃的烘箱中，备用)。

1.2 供试农田土壤样品

在湖南农业大学耘园试验基地的旱地中分别采集具有湖南代表性的第四纪红土红壤样品和河潮土样品，去掉其中的碎石、杂草与植物根茎等杂物，风干、混合均匀，过830 μm筛，用四分法留取5 kg左右装入洁净的封口桶中，贴好标签，备用。2种供试农田土壤的主要理化指标见表1。

表1 2种供试农田土壤的主要理化指标Table 1 Main physicochemical properties of two tested farmland soils

1.3 标准工作曲线的绘制

准确称取抗倒酯、抗倒酸标准品各0.101 0 g，分别转入到100 mL的棕色容量瓶中，用色谱甲醇溶解，配制成质量浓度1 000.0 mg/L的标准母液。采用梯度稀释法，将抗倒酯和抗倒酸的标准储备溶液分别用色谱甲醇稀释成质量浓度0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mg/L的抗倒酯和抗倒酸混合标准工作溶液，用Agilent Technologies 1260进行测定。检测条件：Agilent Zorbax 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0μm)；柱温 35 ℃；流速 0.6 mL/min；进样量 20 μL；流动相A为磷酸水溶液(pH=3)，流动相B为甲醇溶液；检测波长为280 nm；用峰面积外标法定量；抗倒酸相对保留时间约为6.9 min，抗倒酯相对保留时间约为12.4 min。分别以抗倒酯及抗倒酸标准工作溶液的质量浓度为横坐标(x)，以相应的色谱峰峰面积为纵坐标(y)绘制标准工作曲线。

1.4 添加回收试验

准确称取已制备好的第四纪红土红壤和河潮土各20.0 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，分别添加抗倒酯和抗倒酸的混合标准工作溶液，使抗倒酯和抗倒酸的质量浓度分别为 0.05、0.50、5.00 mg/kg，每浓度重复 5次。将土壤样品和抗倒酯及抗倒酸的混合标准溶液混匀，在避光条件下静置30 min，加入40 mL乙腈，并用适量磷酸溶液调节其pH至3.0～3.5，在35 ℃振荡提取30 min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用30 mL乙腈分2次洗涤残渣，收集全部滤液，将滤液转入250 mL磨口三角瓶中，在旋转蒸发仪 45 ℃浓缩至近干，用色谱甲醇定容至2.0 mL后转入5.0 mL离心管中，再加入0.2 g氟罗里硅土，在涡旋混合仪上涡旋2 min，在离心机上以转速3 800 r/min离心2 min，取上清液过0.45 μm膜，进行HPLC-UV检测，计算添加回收率。

1.5 残留消解动态试验

准确称取已制备好的第四纪红土红壤和河潮土各500.0 g，分别置于2 000 mL带盖塑料桶中，再分别向农田土壤样品中添加抗倒酯和抗倒酸的混合标准工作溶液，使抗倒酯和抗倒酸的质量浓度分别为1.00 mg/kg。将其中的有机溶剂(甲醇)挥发至干，过830 μm筛3遍，将土壤样品和抗倒酯及抗倒酸的混合标准溶液混合均匀，加入蒸馏水至第四纪红土红壤和河潮土的持水量均为其最大持水量的70%(500.0 g第四纪红土红壤中加水233.3 mL，500.0 g河潮土中加水175.0 mL。预试验得知第四纪红土红壤的最大持水量为66.7%，河潮土的最大持水量为50%)。为便于通气，在塑料桶盖上打4个小孔。盖好塑料桶，将其置于20 ℃恒温生化培养箱中避光培养。采用恒重法使试验用塑料桶中供试农田土壤的持水量保持不变。在施药处理后的第1、3、5、7、14、21、28 天分别采集供试第四纪红土红壤和河潮土，测定其中抗倒酯和抗倒酸的残留量，并同时称取 20.0 g供试土壤样品至洗净的铝盒(恒重)中，于105～110 ℃烘箱中烘6～8 h，称重，测定供试土壤的含水率。计算抗倒酯和抗倒酸在2种供试农田土壤中的残留量和消解半衰期及拟合消解方程。

2 结果与分析

2.1 抗倒酯和抗倒酸的标准工作曲线

在选定的HPLC-UV检测条件下，抗倒酯和抗倒酸标准溶液的质量浓度(x，mg/L)与其相对应的色谱峰面积(y)均呈良好的线性关系，抗倒酯的线性方程为y=85.75x-2.219，相关系数R2=0.999；抗倒酸的线性方程为y=88.93x-3.167，相关系数R2=0.999。二者均符合农药残留量分析与检测的技术要求。

2.2 添加回收试验结果

抗倒酯在第四纪红土红壤中的添加回收率为79.68%～103.55%，平均添加回收率为 90.01%～97.63%，相对标准偏差为 1.83%～10.22%；抗倒酯在河潮土中的添加回收率为80.99%～ 97.45%，平均添加回收率为 86.52%～94.46%，变异系数为1.26%～6.09%(表2)。抗倒酯在第四纪红土红壤和河潮土中的最小检测浓度均为0.05 mg/kg，最小检测量为 1.0×10-9g。

表2 抗倒酯和抗倒酸在供试土壤中的添加回收率Table 2 Additive recoveries of trinexapac-ethyl and trinexapac in two tested farmland soils

抗倒酸在第四纪红土红壤中的添加回收率为79.18%～104.13%，平均添加回收率为 88.43%～96.19%，变异系数为 3.29%～10.75%；抗倒酸在河潮土中的添加回收率为85.69%～ 101.12%，平均添加回收率为 92.82%～95.46%，变异系数为 4.33%～7.38%(表2)。抗倒酯和抗倒酸在第四纪红土红壤和河潮土中的最小检测浓度均为0.05 mg/kg，最小检测量均为1.0×10-9g。

以上结果表明，所建立的检测抗倒酯和抗倒酸在2种供试农田土壤中残留的方法均符合农药残留量分析与检测的技术要求，可以用于对农田土壤样品进行检测。

2.3 残留消解动态试验结果

在 20 ℃恒温和避光培养条件下，抗倒酯在第四纪红土红壤和河潮土中处理0.021 d(30 min)的残留量分别为0.99、1.02 mg/kg，其残留消解率未超过 5%；抗倒酸在第四纪红土红壤和河潮土中处理0.021 d的残留量分别为0.98、1.04 mg/kg，其残留消解率也未超过5%。

由表3可见，在20 ℃恒温和避光培养条件下，抗倒酯在第四纪红土红壤中的残留消解较快，消解率在处理3 d时为23.23%，在处理7 d时为61.62%，在处理28 d时达91.92%；抗倒酯在河潮土中的残留消解也较快，其消解率在处理3 d时为28.43%，处理7 d时为57.84%，处理28 d时达88.24%。抗倒酯在第四纪红土红壤中的消解方程为Ct=0.865 8e-0.0777t，相关系数R2=0.952 1，其消解半衰期为8.92 d；抗倒酯在河潮土中的消解方程为 Ct=0.845 8e-0.0904t, 相关系数R2=0.967 9，其消解半衰期为7.67 d。抗倒酯在偏碱性河潮土中的消解比在偏酸性第四纪红土红壤中的消解快1.25 d，表明抗倒酯在碱性农田土壤中更容易消解，但二者在2种供试农田土壤中的消解半衰期均小于9.0 d。

由表3可见，在20 ℃恒温和避光培养条件下，抗倒酸在第四纪红土红壤中的残留消解较快，其消解率在处理 3 d时为 29.59%，在处理 7 d时为58.16%，在处理28 d时为88.78%；抗倒酸在河潮土中的残留消解较慢，其消解率在处理 3 d时为28.85%，在处理7 d时为56.73%，在处理28 d时为86.54%。抗倒酸在第四纪红土红壤中的消解方程为Ct=0.852 1e-0.0807t，相关系数R2=0.959 1，消解半衰期为 8.59 d；抗倒酸在河潮土中的消解方程为Ct=0.883 5e-0.0738t，相关系数R2=0.947 7，消解半衰期为9.39 d。抗倒酸在偏酸性第四纪红土红壤中消解比在偏碱性河潮土中慢0.8 d，表明在酸性农田土壤中，抗倒酸比抗倒酯消解快，不过二者在2种供试农田土壤中的消解半衰期都小于9.5 d。

表 3 抗倒酯和抗倒酸在供试土壤中的残留量和残留消解率Table 3 Residue and degradation of trinexapac-ethyl a nd trinexapac in two tested farmland soils

3 结论与讨论

抗倒酯在偏碱性农田土壤中比抗倒酸消解快的原因可能是酯类物质在碱性条件下易水解，抗倒酯在碱性条件下的溶解度大于其在酸性条件下的溶解度。在偏酸性农田土壤中，抗倒酸比抗倒酯更易消解的原因是抗倒酸为抗倒酯的消解代谢产物，其极性比抗倒酯的强，在酸性条件下的溶解度较大。可见，农田土壤pH值是影响抗倒酯和抗倒酸消解的主要因素。抗倒酯和抗倒酸自身化学性质和特点对消解的影响还有待研究。

抗倒酯和抗倒酸在第四纪红土红壤和河潮土中的残留与消解虽然存在差异，但差异不大，其消解半衰期均小于9.5 d，表明抗倒酯及其代谢物抗倒酸不易在农田土壤中形成残留危害。

当抗倒酯和抗倒酸标准工作溶液的质量浓度为0.05～5.00 mg/L时，抗倒酯和抗倒酸标准工作溶液的质量浓度与其对应色谱峰面积呈良好的线性关系，符合农药残留量分析与检测的相关技术要求。

抗倒酯和抗倒酸在第四纪红土红壤和河潮土中的添加回收试验结果均符合农药残留量分析与检测的技术要求，且其最小检出浓度均为 0.05 mg/kg，其最小检出量为1.0×10-9g。

[1] 杨代斌，袁会珠，王纪华，等．环己烷三酮类植物生长调节剂[J]．世界农药，2002，24(4)：46-49．DOI：10.3969/j.issn.1009-6485.2002.04.013.

[2] 孙旭春，顾洪如，沈益新，等．抗倒酯对多花黑麦草生长与倒伏的影响[J]．江苏农业学报，2012，28(1)：140-144．DOI：10.3969/j.issn.1000-4440.2012.01.026.

[3] 谢新春，李佳岭，刘天增，等. 抗倒酯在果岭化学修剪中的应用[J]. 草原与草坪，2013，33(5)：1-5.

[4] 高晨浩，濮阳雪华，张利娟，等．抗倒酯浸种对多年生黑麦草幼苗生长及生理特性的影响[J]．中国农学通报，2014，30(15)：98-104.

[5] BORM G E L，VAN DEN BERG W．Effects of the application rate and time of the growth regulator trinexapac-ethyl in seed crops of Lolium perenne L．in relation to spring nitrogen rate[J]．Field Crops Research，2008，105(3)：182-192．DOI：10.1016/j.fcr.2007.10.001.

[6] ANDERSON N P，MONKS D P，CHASTAIN T G，et al.Trinexapac-ethyl effects on red clover seed crops in diverse production environments[J]．Agronomy Journal，2015，107(3)：951．DOI：10.2134/agronj14.0399.

[7] FARIA A T，FERREIRA E A，ROCHA P R R，et al.Effect of trinexapac-ethyl on growth and yield of sugarcane[J]．Planta Daninha，2015，33(3)：491-497．DOI：10.1590/s0100-83582015000300011.

[8] SYHRE M，HANSCHMANN G，HEBER R．Problems in analyzing trinexapac-ethyla new plant growth regulator[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(1)：178-179．DOI：10.1021/jf960504+.

[9] 姜宜飞，赵永辉，于荣．抗倒酯250 g/L乳油高效液相色谱分析方法研究[J]．农药科学与管理，2010，31(8)：43-45．DOI：10.3969/j.issn.1002-5480.2010.08.016.

[10] 黄何何，张缙，徐敦明，等．QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果中21种植物生长调节剂的残留量[J]．色谱，2014，32(7)：707-716．DOI：10.3724/SP.J.1123.2014.03003.

[11] 张玉婷，李娜，刘磊，等．超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦和土壤中抗倒酯及其代谢物残留量[J]．分析试验室，2014，33(6)：671-674.

[12] 钟蕾，孙雪梅，金明姣，等．抗倒酯及抗倒酸在小麦中的残留与消解动态[J]．贵州农业科学，2016，44(4)：48-52．DOI：10.3969/j.issn.1001-3601.2016.04.013.

[13] HIEMSTRA M，DE KOK A．Determination of trinexapac in wheat by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]．J Agric Food Chem，2003，51(20)：5855-5860．DOI：10.1021/jf030302v.

责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Development and application of the residual determination on trinexapac-ethyl and its degradation product trinexapac in farmland soil

GONG Yi1.2, YANG Lihua1, PEN Xiaochun2*, GONG Daoxin1*
(1.Institute of Agric-Environmental Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.South China Institute of Environmental Science, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China)

The determination approach for trinexapac-ethyl, and its degradation product, trinexapac was set up through the additive recovery experiment with HPLC-UV technology to understand their residual level and degradation rule in farmland soil. The residues of trinexapac-ethyl and trinexapac in farmland soil were firstly extracted using acidic acetonitrile, and the extract was purified with florisil dispersive solid phase extraction, then we employed HPLC-UV to detect their residue. The results showed that when the additive concentration of trinexapac-ethyl varied from 0.05 to 5.00 mg/kg, the additive recoveries changed from 79.68% to 103.55%, with the coefficient of variation varied from 1.26% to 10.22%; while, the trinexapac,s recoveries varied from 79.18% to 104.13%, and its variation coefficient varied from 3.29% to 10.75%. The approach met the technical needs for pesticide residue analysis and determination. A case study of the residue and degradation on trinexapac-ethyl and trinexapac in two kinds of typical farmland soil, i.e., quaternary red soil and alluvial soil from Hunan were conducted under indoor simulation culture experiment at 20 ℃ and dark condition, the results showed that their residue and degradation accorded with the first-order kinetic equation which was written as Ct=C0·e-kt, and the degradation half-life of trinexapac-ethyl was 8.92 days in quaternary red soil, and 7.67days in alluvial soil; while those of trinexapac was 9.39 days and 8.59 days, respectively. Both the degradation rate of trinexapac-ethyl and trinexapac were faster in the two kinds of typical farmland soil, and it was no risk to the farmland soil environment.

trinexapac-ethyl; trinexapac; determination; residue degradation; quaternary red soil; alluvial soil

S482.8

A

1007-1032(2017)04-0438-05

2017-04-14

2017-05-14

农业部农业行业标准制定和修订(农产品质量安全)项目(18162130109237117)；2014—2016年农药残留试验研究项目(2014H108)

龚毅(1990—)，男，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事农药残留分析与检测及有机污染物修复治理等方面的研究。*通信作者，龚道新，教授，主要从事农药残留及其生态环境行为与安全性评价研究，286013756@qq.com；*通信作者，彭晓春，研究员，主要从事环境影响评价及污染物防控研究，gdx4910@163.com。