棉籽油中游离棉酚脱毒评价新方法

武 钰，闫明俞，耿文宁，李海芳，姚 军

（1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆 乌鲁木齐 830004）

棉籽油中游离棉酚脱毒评价新方法

武 钰1，闫明俞2，耿文宁2，李海芳2，姚 军1

（1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆 乌鲁木齐 830004）

由于棉籽油中游离棉酚在常温下极易降解（30d内降解80%以上），现有国标方法很难反映棉籽油的脱毒情况。该文通过自制未脱毒棉籽油样品，考察游离棉酚在棉籽油中的降解情况，确定主要游离棉酚降解产物并鉴定其化学结构，建立棉籽油中主要游离棉酚降解产物的含量测定方法。经LC-FTICRMS质谱仪检测，主要游离棉酚降解产物m/z为573.25033，推测其分子式为C34H37O8，鉴定结构为四甲氧基棉酚。对24批市售棉籽油样品进行检测，其中20批棉籽油样品检测到主要游离棉酚降解产物，含量为0.139～0.912μg/mL。通过测定棉籽油中主要游离棉酚降解产物反映游离棉酚的脱毒情况，证明该方法切实可行，可为新疆地区棉籽油的生产和监管提供有效检测方法。

棉籽油；游离棉酚降解产物；结构鉴定；四甲氧基棉酚

0 引 言

棉籽油（cottonseed oil）是从棉花属植物种子中提炼的食用油，主要来源为陆地棉和草棉。棉花是一种重要的生活资料，新疆作为我国重要的棉花产地，棉花产量约占全国的50%以上，副产物棉籽也成为当地重要的油料及蛋白饲料资源，因此新疆是我国棉籽加工的重要基地。在棉籽油生产加工、食用过程中，棉籽中的内源性物质——棉酚（gossypol）成为研究关注的重点，由于游离棉酚具有明确的毒副作用，并且在棉籽中含量较大，因此棉籽油生产工艺中非常重要的环节就是棉酚的脱毒工艺[1]。因棉酚在棉籽油中极易降解（30d内降解80%以上），而目前国家标准中仅规定了棉籽油中棉酚的检测方法及限量，不足以反映棉籽油中棉酚脱毒情况[2-3]。本文通过自制未脱毒的棉籽油样品，室温放置，不同时间进行检测，建立棉酚与降解产物之间的量变关系。通过检测棉籽油中降解产物的含量，计算棉酚的含量，从而考察棉籽油的脱毒情况，建立棉籽油中游离棉酚脱毒评价新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Agilent 1220 LC二元泵高效液相色谱仪；SHIMADZU LC-6AD半制备型液相色谱仪；Bruker Daltonics SolariX 9.4 Tesla LC-FTICRMS质谱仪；KQ-500DE数控超声清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；BS110S电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；EYELA OSB-210旋转蒸发仪。

1.2 样品与试药

甲醇（色谱纯，Fisher Scientific，美国）；乙腈（色谱纯，Fisher Scientific，美国）；磷酸（优级纯，成都市科龙化工试剂厂）；乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；本文所检测的24批市售棉籽油样品均来自新疆各地榨油厂。

2 样品前处理

2.1 未脱毒棉籽油的制备

棉籽油的提取工艺主要有溶剂浸提法、溶剂超声法，超临界CO2萃取法等[4-7]。本文根据新疆地区棉籽油的生产工艺，采用正己烷浸提法提取未脱毒棉籽油。将棉籽脱壳，蒸炒，用粉碎机粉碎，过20目筛，备用。称棉籽粉末50g，置于500mL三角瓶中，倒入正己烷并将瓶口密封，料液比为1∶4，浸出温度60℃，浸出时间为150min。过滤除渣，蒸发脱溶，即得未脱毒的棉籽油粗品。

2.2 供试品溶液的制备

称取棉籽油样品1g（精确至0.01g）于离心试管中，加入5mL无水乙醇，剧烈振摇2min，静置分层，取上清液滤纸过滤，4000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，即为供试品溶液。

2.3 采用半制备型液相色谱仪制备棉酚降解产物

将在室温下放置30d的棉籽油，按上述方法制备供试品溶液。色谱柱YMC-Pack ODS-A（250mm×20 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水（70∶30，ν∶ν），流量4.0mL/min，柱温为室温，25～30℃，检测波长 235nm，进样量4mL。所制备的棉酚降解产物纯度为80%，作为工作标样，见图1。

图1 降解后的棉籽油HPLC图

3 棉酚降解产物化学结构的初步鉴定

3.1 LC-FTICRMS条件

采用电喷雾离子源负离子模式，质量扫描范围准分子离子为110～1 200，喷雾电压2 700V，毛细管温度110℃，源温75℃，锥孔电压-7.5V，检测激发电压130V。Acclaim®120 C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流动相为甲醇∶0.1%甲酸（90∶10，ν∶ν），流量0.2mL/min，柱温 30℃。

3.2 分子量的测定

经质谱仪检测，可知棉酚降解产物m/z 573.250 33，分子式为C34H37O8，结果见图2。

图2 棉酚降解产物质谱图

3.3 分子结构的推测

由于棉酚的酚羟基不稳定，在放置过程中，酚羟基中的H易发生甲基化反应。根据棉酚降解产物准确分子量为574.249 39，经质谱仪检测降解产物m/z 574.25033，本试验所使用的质谱仪为高分辨质谱，测定值可精确至小数点后5位，由于理论分子量与测定分子量非常接近，故推测降解产物的结构为四甲氧基棉酚[8-10]，如图3所示。

4 棉籽油中游离棉酚与降解产物之间的量变关系

将5份未脱毒的棉籽油粗品放置在25℃室温下，不避光保存，作为平行样。每份棉籽油粗品均分别在 0，5，10，20，30d 取样，放置于-21℃冰箱中，按 2.2 制备供试品溶液，按5.1项下色谱条件测定。结果发现，随着放置时间的增加，棉酚峰面积逐渐减小的同时，降解产物峰面积逐渐增加，结果见图4。以降解产物峰面积为X轴，棉酚峰面积为Y轴作图，线性方程 Y=-3.006 743 95X+2 058 258 982，r=0.990 0。结合外标一点法计算游离棉酚与降解产物之间的量变关系为Cs=3.0Ci，Cs为游离棉酚浓度，Ci为降解产物浓度。

图3 四甲氧基棉酚化学结构式

图4 不同放置时间棉籽油中游离棉酚降解情况HPLC图

5 棉籽油中游离棉酚降解产物HPLC检测方法的建立

5.1 色谱条件

色谱柱Inertsil®ODS-3（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇∶2%磷酸（85∶15，ν∶ν），流量 1.0mL/min，柱温40℃，检测波长235nm。

5.2 方法学考察

5.2.1 线性关系考察

精密称取已制备的棉酚降解产物工作标样10mg，用乙醇定容至250mL容量瓶中，即得质量浓度为0.04 mg/mL的棉酚降解产物储备液，以无水乙醇稀释至1 μg/mL的降解产物溶液。精密吸取该溶液各 1，2，4，6，8，10 mL 置于 10 mL 棕色容量瓶中，用无水乙醇定容。按5.1项下色谱条件测定，记录峰面积。棉酚降解产物在0.1～1μg/mL范围内线性良好。得线性回归方程为：Y=110 520 637.5X-582 707.5，r=0.9995。

5.2.2 精密度试验

同一份棉酚降解产物溶液，按5.1项下色谱条件测定，日内连续进样5次，记录峰面积。测得棉酚降解产物日内峰面积R SD为0.22%。

5.2.3 重复性试验

精密称取同一批棉籽油样品5份，各1 g（精确至0.01g）于离心试管中，按2.2制备供试品溶液。按5.1项下色谱条件测定，记录峰面积。测得棉酚降解产物峰面积R SD为1.80%。

5.2.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液，于 0，2，4，8，12，24h 进样测定，记录峰面积。测得棉酚降解产物峰面积R SD为0.75%。

5.2.5 加标回收率试验

精密称取已知含量的棉籽油样品9份，各0.5g，每3份为一组作为平行样，分别加入质量浓度为0.04 mg/mL的棉酚降解产物储备液各3.00，3.75，4.50mL于离心管中，按上述方法制备供试品溶液。按5.1项下色谱条件测定，记录峰面积，棉酚降解产物的平均回收率为93.2%，R SD为3.93%（结果见表1）。

5.3 市售棉籽油中棉酚降解产物含量的测定

将市售的24批棉籽油样品按上述方法制备供试品溶液，按5.1项下色谱条件测定。研究发现，24批市售棉籽油均未检测到棉酚，其中有20批市售棉籽油样品检测到降解产物，为0.139～0.912μg/mL，相当于棉籽油中棉酚质量浓度为0.417～2.736μg/mL，结果见表2。将市售棉籽油样品与未脱毒棉籽油样品HPLC图对比，结果见图5。

表1 游离棉酚降解产物回收率试验

表2 24批市售棉籽油样品中棉酚降解产物含量

图5 市售棉籽油与未脱毒棉籽油HPLC图

6 结束语

由于棉酚在棉籽油中极易降解，在棉籽油出厂和销售过程中，棉酚很可能已经降解完全。对24批市售棉籽油样品进行检测，均未检测到棉酚。为了还原棉酚在棉籽油中的降解过程，本试验在棉籽油生产过程中未进行脱毒处理，得到的棉籽油粗品中棉酚含量较高。通过对不同放置时间的未脱毒棉籽油进行检测，发现随着放置时间的增加，棉酚峰面积逐渐减小的同时，降解产物峰面积逐渐增加，且两者之间呈现一定的量变关系。

本试验采用高分辨质谱对棉酚降解产物的分子量进行测定，并推测其主要结构可能为四甲氧基棉酚。在后续的实验中，将对降解产物进行化学合成实验，并通过紫外、红外、质谱、核磁共振的检测，最终确定降解产物的结构。

本文通过游离棉酚与降解产物之间的量变关系，建立了棉籽油中棉酚脱毒评价新方法，从而提高棉籽油的安全质量。

[1]栾姝，孟磊，孙莲，等.高效液相色谱法测定棉籽仁中棉酚的含量[J].食品科学，2010，31（4）：198-200.

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[5]张飞，薛晓金.异丙醇浸出棉籽油的研究[J].中国油脂，2008，33（7）：13-16.

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（编辑：莫婕）

A new detoxification evaluation method of free gossypol in cottonseed oil

WU Yu1，YAN Mingyu2，GENG Wenning2，LI Haifang2，YAO Jun1
（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Food and Drug Administration，Urumqi 830004，China）

Through current national standards the detoxication of cottonseed oil is hard to be detected because the free gossypol in cottonseed oil can easily be degraded at room temperature with a speed of over 80% of its contents within 30 days.This test examines the quantitative relationship between free gossypol and its degradation products by making undegraded cottonseed oilsamples，identificates chemicalstructure ofmain gossypoldegradation products and also establishes a new method to evaluate free gossypol detoxification in cottonseed oil.According to the LC-FTICRMS，the main degradation products of free gossypol m/z was 573.250 33，the molecular formula is C34H37O8，its structure identified as tetramethoxyl gossypol.24 batches of cotton seed oil samples were tested，and the main free gossypol degradation products were detected in 20 batches of cottonseed oil，the content of which was from 0.139 to 0.912 μg/mL.By testing the gossypol detoxification of the degradation products in cottonseed oil，the method is proven feasible as a new method of free gossypol detoxification evaluation in cottonseed oil.

cottonseed oil；free gossypol degradation products；structure identification；tetramethoxyl gossypol

A

1674-5124（2017）04-0052-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.04.012

2016-10-20；

2016-11-15

国家自然科学基金（31160322，31460417）

武 钰（1990-），女，吉林梅河口市人，硕士研究生，专业方向为药物分析。

姚 军（1973-），男，湖北襄阳市人，副教授，博士，主要从事药物质量标准研究。李海芳（1977-），女，甘肃张掖市人，副主任药师，主要从事药理毒理研究。