两种测定酱油中氨基酸态氮方法的探讨

章银珠，赵春玲，张书芬

（宁波市食品检验检测研究院，浙江宁波315000）

两种测定酱油中氨基酸态氮方法的探讨

章银珠，赵春玲，张书芬

（宁波市食品检验检测研究院，浙江宁波315000）

该研究探讨了酱油中氨基酸态氮测定的两种方法：酸度计法和比色法。因两种方法间有无差异尚未有定论，依据GB5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》标准，通过探讨影响测定结果的关键因素和操作注意事项来保证方法的准确性，再抽取市售10种酱油，分别用两种方法测定其氨基酸态氮含量，试验结果显示，两种方法检测结果无显著性差异（P＞0.05）。

酱油；氨基酸态氮；酸度计法；比色法

酱油是我国传统的调味品，具有悠久的历史，其味道鲜美，富含多种营养物质，集调色、调味于一体。酱油独特的美味主要是鲜味，LIOE H N等[1-2]指出，酱油的鲜味主要是一些分子质量＜500 u的成分，而游离氨基酸是在钠盐存在情况下对味觉有重要作用的低分子化合物。还有一些肽类物质尽管含量极低，但是对鲜味也有很大的贡献。因此，氨基酸态氮含量的高低是衡量酱油质量优劣的重要指标。

氨基酸测定的方法通常是基于氨基酸的分子结构来定量其中的氨基或者羧基。酱油的国家标准GB 18186—2000《酿造酱油》规定了其氨基酸态氮含量的检测方法为甲醛值法，其原理为定量羧基，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准滴定溶液定量。该法分析成本低，测定结果准确，因此应用十分广泛，但是速度较慢，检测过程中的影响因素也较多。新实行的国标GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》规定了酱油氨基酸态氮的检测方法分别为酸度计法（甲醛值法）和比色法[3]。比色法的原理为定量氨基，操作简便、灵敏、快速、取样量少，适合批量处理，但是该法应用不普遍，且与酸度计法相比，两者结果的差异性尚未有定论：胡明友[4]认为两法无显著性差异（P＞0.05），结果令人满意；刘佳宁[5]的检测结果是两法有显著性差异（P＜0.05）。本实验用这两种方法分别对市售的多种不同等级的酱油的氨基酸态氮含量进行多次测定，进行比较，以期得到一个可靠的结果，供检验同行以借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醛溶液（体积分数36%～38%）、氢氧化钠标准滴定溶液（0.05 mol/L）、乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.8）、显色剂（15mL37%甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀）、氨基酸态氮标准储备液（1.0 mg/mL、0.1 mg/mL）：国药集团化学试剂有限公司。

酱油样品（15种样品分别编号为1#～15#）：市售。

1.2 仪器与设备

PB-21酸度计：德国赛多利斯公司；T6系列紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 酸度计法[6]

称取5.0g（精确至0.1mg）试样（m），用水稀释至100mL（V4）混匀。吸取10.0 mL（V3）稀释液于烧杯中，加60 mL水，在磁力搅拌下用浓度（c）为0.05 mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液滴定至酸度计指示pH为8.2。加入10.0mL甲醛溶液，混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至酸度计指示pH为9.2。记录加入甲醛溶液后消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积（V1）。同时取70 mL水，做试剂空白试验（V2）。氨基酸态氮计算公式如下：

1.3.2 比色法

标准曲线制作：移取氨基酸态氮标准使用溶液0、0.05 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL（相当于NH3-N0、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg）分别于10 mL比色管中，加入4 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液及4 mL显色剂，用水稀释至刻度混匀。置100℃水浴中加热15min后取出，冷却至室温后移入1 cm比色皿内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度值，绘制氨基酸态氮标准曲线线性回归方程。

称取1.00 g（m）试样于100 mL（V2）容量瓶，用水稀释至刻度混匀。吸取0.50 mL（V1）稀释液于10 mL比色管中，加入4 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液及4 mL显色剂，用水稀释至刻度混匀。置100℃水浴中加热15 min后取出，冷却至室温后移入1 cm比色皿内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度值。同时进行样品空白试验。试样吸光度值扣除样品空白吸光度值后，代入线性回归方程，按如下公式计算试样氨基酸态氮含量。

2 结果与分析

2.1 比色法

2.1.1 氨基酸态氮标准曲线的绘制

以氨基酸态氮含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 氨基酸态氮标准曲线Fig.1 Standard curve of amino acid nitrogen

由图1可知，标准曲线回归方程为y=0.110 3x，在0～100.0 μg线性范围内，相关系数R2为0.999 3，表明二者线性良好。

2.1.2 回收率测定

对比色法进行加标回收率试验，结果见表1。

表1 加标回收率试验结果Table 1 Results of recovery rate tests

由表1可知，加标回收率在92.5%～101.3%，表明该法准确度高，符合相关实验要求。

2.1.3 显色剂放置时间对测定的影响

用放置不同时间的显色剂显色，重新绘制标准曲线，同时对同一个样品进行测定并测定其加标回收率，结果见表2。

表2 放置不同时间的显色剂对标准曲线单点的测定结果Table 2 Determination results of standard curves single point with chromogenic agents placed with different time

由表2可知，随着显色剂放置时间的延长，氨基酸态氮含量测定结果线性下降，测定结果也偏低。

2.1.4 样品空白对测定的影响[7]

酱油本身颜色较深，市售的酱油老抽颜色较深，而生抽则颜色相对较浅。对不同的酱油（3种生抽、3种老抽）进行样品空白处理：即试样稀释液0.5 mL，加入4 mL缓冲溶液，用水定容至10 mL，于波长400 nm处测定吸光度值，样品空白吸光度值见表3。

表3 不同酱油样品空白吸光度值Table 3 Blank absorbance value of different soy sauce samples

由表3可知，不同颜色深度的酱油空白吸光度值不同，生抽较小可忽略，而老抽的空白吸光值较大，因此需要扣除样品空白。

2.2 两种方法间测定结果比较[8-12]

另取市售酱油15个样品（1#～15#），分别用酸度计法和比色法对其中的氨基酸态氮含量进行测定，测定结果见表4。

表4 两种方法测定氨基酸态氮的结果比较Table 4 Comparison of two methods for the determination results of amino acid nitrogen

由表4可知，经过方差分析（α=0.05），两种方法测定结果无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论[13-15]

GB 18186—2000《酿造酱油》规定用g/100 mL来表示氨基酸态氮的含量，但是因酱油的密度较大，同样1 mL的样品，质量约为1.13～1.21 g，且用移液管或移液器移取液体时也有误差，这样折合成g/100 mL的含量，两者差异较大。因此，笔者认为用g/100g来表示含量更为精确。

4 结论

依据GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》标准，通过探讨影响测定结果的关键因素和操作注意事项来保证方法的准确性，再抽取市售10种酱油，分别用两种方法测定其氨基酸态氮含量，试验结果显示，两种方法检测结果无显著性差异（P＞0.05）。

[1]LIOE H N,SELAMAT J,YASUDA M.Soy sauce and its umami taste:A Link from the past to current situation[J].J Food Sci,2010,75:71-76.

[2]SYIFAA A S,JINAP S,SANNY M,et al.Chemical profiling of different types of soy sauce and the relationship with its sensory attributes[J].Food Qual,2016,39:714-725.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.235—2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]胡明友.酱油中氨基酸态氮的比色法测定可行性验证[J].浙江预防医学，2005，17（7）：20-21.

[5]刘佳宁.论酱油中氨基酸态氮检测数据准确性相关影响因素[J].食品工程，2015（4）：58-60.

[6]国家质量技术监督局.GB 18186—2000酿造酱油[S].北京：中国标准出版社，2000.

[7]章银珠，赵春玲，沙晨.影响酱油中氨基酸态氮含量测定空白值的因素[J].食品研究与开发，2014，35（1）：82-83.

[8]NIELSEN S S.Food analysis laboratory manual[M].Kluwer:Kluwer Academic Publisher,2006:20-35.

[9]张文德，尹璐，马志东，等.用Hantzsch反应光度法测定食品中蛋白质的研究[J].卫生研究，1997，26（5）：340-342.

[10]姜雪，苏媛媛，刘小勤.酱油中氨基酸态氮的来源及不合格研究[J].广东化工，2017，44（4）：69-70.

[11]郭峰，王斌，陆洋.酱油中总酸和氨基酸态氮成分的快速检测及研究[J].食品科学，2006，27（12）：699-703.

[12]LIN S Y,LO Y C,CHEN Y K,et al.Nonvolatile taste components and functional compounds of commercial soy sauce products[J].Food Process Pres,2015,39(6):2680-2686.

[13]姚玉静，陈嘉辉，尹文颖.固形物浓度对高盐稀态酱油滋味物质的影响[J].食品工业科技，2017，38（8）：133-138.

[14]鲁长豪.食品理化检验学[M].北京：人民卫生出版社，1992：31-34.

[15]李里特.大豆加工与利用[M].北京：化学工业出版社，2003：216-240.

Two methods for determination of amino acid nitrogen in soy sauce

ZHANG Yinzhu,ZHAO Chunling,ZHANG Shufen
(Ningbo Academy of Food Inspection and Testing,Ningbo 315000,China)

Two methods(pH meter and colorimetric method)for the determination of amino acid nitrogen in soy sauce were discussed.It is not clear whether there is any difference between the two methods.According to the national standard GB 5009.235—2016''The determination of amino acid nitrogen in food'',the key factors influencing the results of determination and operation cautions to ensure the accuracy of the method were discussed, and then the content of amino acid nitrogen in 10 commercial soy sauce samples were determined by the two methods.The results showed that there was no significant difference between test results of two methods(P＞0.05).

soy sauce;amino acid nitrogen;pH meter method;colorimetric method

TS264.2

0254-5071（2017）06-0163-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.033

2017-03-29

章银珠（1983-），女，工程师，硕士，主要从事食品理化检测工作。