IGF2、H-FABP和RPL9基因在豫南黑猪和三元杂交猪中的差异表达

白 鹭，景亚星，冯 硕，孙 港，郑振宇

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002）

IGF2、H-FABP和RPL9基因在豫南黑猪和三元杂交猪中的差异表达

白 鹭，景亚星，冯 硕，孙 港，郑振宇*

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002）

本研究旨在探析IGF2、H-FABP和RPL9基因在猪不同组织和两种猪间的表达差异。选用体重70 kg左右的杜×长×大三元杂交猪和豫南黑猪，分别采集其心、肝、脾、肺、肾、腹部脂肪和背部皮下脂肪，进行总RNA提取及不同基因的荧光定量PCR实验。结果表明：在豫南黑猪心脏、肝脏和脾脏组织中IGF2基因的转录水平约为三元杂交猪的225.0倍（P＜0.05）；豫南黑猪心脏、脾脏和皮下组织中H-FABP 基因的转录水平高于三元杂交猪，其中脾脏组织H-FABP的表达量约为三元杂交猪的6.8倍（P＜0.05），而三元杂交猪肺脏和腹部脂肪H-FABP表达量约为豫南黑猪的2.7倍（P＜0.05）；RPL9基因在豫南黑猪心、肝、肺和肾组织中表达量高于三元杂交猪，在脾脏、皮下脂肪和腹部脂肪中表达量低于三元杂交猪内表达量，其中皮脂中的表达量差异最大，三元杂交猪约为豫南黑猪的4.9倍（P＜0.05）。综上可知，两种猪不同组织间IGF2、H-FABP和RPL9基因的表达差异显著。

豫南黑猪；三元杂交猪；IGF2；H-FABP；RPL9；脂肪沉积

猪是脂肪沉积型动物，其脂肪沉积能力在不同品种间差异非常明显。豫南黑猪是以河南地方优良猪种淮南猪为母本，通过大比例（62.5%）导入杜洛克猪血统，经过11年9个世代选育而成。与国外品种相比，豫南黑猪生长速度慢，但具有肉质好、母性佳和抗应激、疾病能力强等优点[1]。杜×大×长三元杂交猪育肥性好，即体型好、生长快、瘦肉多、饲料报酬高，是目前国内推广最多、最广的杂交组合之一[2-3]。肌内脂肪（Intramuscular Fat, IMF）含量是影响猪肉品质的重要因素之一，与猪肉的嫩度和风味等直接相关。在猪肉生产中，动物机体的脂肪沉积对于保障动物健康和提高肉产品品质具有重要的作用[4]。但脂肪的过度沉积不但影响猪胴体品质，还会影响养殖者的经济利益，因此对猪脂肪沉积相关基因的研究有着重要的意义。

本实验以瘦肉率差异明显的豫南黑猪和杜×大×长三元杂交猪为研究对象，采用荧光实时定量RT-PCR技术，研究猪不同组织中IGF2、H-FABP和RPL9基因表达差异，并分析2个品种间基因表达的差异，以揭示不同品种猪脂肪沉积和肥胖程度差异的遗传影响因素。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物来源 豫南黑猪来自开封某个体养殖户；杜×大×长三元杂交猪来自开封福生翔屠宰场。

1.1.2 主要仪器 冷藏冰箱（海尔公司）；HH-2 数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；台式离心机（德国Sigma公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；AB204-N 型电子天平（Mettler-Toledo Group）；PTC-200 型 PCR 仪（M J Research 公司）；CFX96 Real-Time PCR仪（ BioRad 公司）；DYCZ-Ш28A 型电泳槽（北京六一仪器厂）；紫外凝胶成像系统（美国SIM公司）；移液器（德国Eppendorf公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司）。

1.1.3 主要试剂 TRIzon Reagent（康为世纪公司）；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（康为世纪公司）；琼脂糖（Promega 公司）；SYBR®Premix Ex Taq TMII（TaKaRa公司）；PBS缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集与处理 在福生翔屠宰场将采集到的15头豫南黑猪公猪和15头杜×大×长三元杂交公猪的心、肝、脾、肺、肾、腹部脂肪和背部皮下脂肪置于高压灭菌过的托盘中，并用镊子和手术剪将组织处理成细碎块状，装入标记过的无RNase的离心管中。采样完毕后，取200 mg组织放入盛有液氮的研钵中，先用研杵将组织敲碎，然后研磨成粉末状，期间及时补充液氮防止组织暴露于空气中。

1.2.2 RNA提取和反转录 取研磨后的组织样品于1.5 mL的RNase- Free离心管中，加入500 μL TRIzon，反复吹打使细胞裂解。室温放置5 min，使蛋白核酸复合物完全分离。向溶液中加入100 μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置2～3 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min，此时样品分为红色有机相、中间层和无色水相3层。RNA主要在水相，把水相转移到一个新的RNase- Free离心管中。在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入1 mL75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。4℃、12 000 r/min离心3 min，小心吸弃上清（剩余的少量液体可以短暂离心，用枪头吸出）。室温下放置2～3 min，晾干，加入30～50 μL无RNase的水，充分熔解RNA，得到的RNA保存在-80℃，防止降解。在RNase-Free离心管中加入8 μL dNTP Mix，4 μL Primer Mix，8 μL 5XRT Buffer，4 μL DTT，2 μL HiFiScript，14 μL RNA进行逆转录，总反应体系为40 μL。涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁溶液收集到管底；42℃孵育40 min，85℃孵育5 min。反应结束后，置于冰上冷却，逆转录产物保存于-20℃冰箱，用于荧光定量PCR反应。

1.2.3 荧光定量PCR 参照GenBank公布的猪IGF2、H-FABP和RPL9基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1），并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以β-actin基因为内参基因，进行相对荧光定量PCR反应，反应体系为20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物（25 pmol/L）各0.35 μL，cDNA（1 000 ng/μL）2 μL。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行45个循环。循环结束后升温至95℃ 10 s，再降至65℃持续60 s，递增至95℃ 1 s，采集荧光信号得出扩增产物的熔解曲线，于37℃ 30 s后结束反应。

1.3 统计分析 在荧光定量PCR中，循环阈值（Cq）是反映模板中目标基因含量的重要指标，通过比较目标基因和内参基因 β-actin，消除样品收集和加样操作过程中的误差。采用2-△△Ct法分析数据。数据用SPSS软件进行数据处理分析，采用Duncan's法进行差异显著性检验。结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 IGF2基因的差异性表达 通过荧光定量PCR实验发现（表2），在采集的豫南黑猪各组织中，IGF2基因在肺和肾中的表达量最低，在皮脂中表达量最高，与腹脂相比有显著性差异（P＜0.05）。在采集的三元杂交猪各组织中，IGF2 基因的表达量均很低，腹脂中IGF2基因的表达量最高，约为心脏中表达量的572倍（P＜0.05）。豫南黑猪皮下脂肪和腹部脂肪IGF2的表达量约为三元杂交猪的4.9倍（P＜0.05）；豫南黑猪心脏、肝脏和脾脏组织IGF2表达量约为三元杂交猪的225.0倍（P＜0.05）。

2.2 H-FABP基因的表达差异 由表3可知，H-FABP基因在2个猪种的皮下脂肪表达量显著高于其他组织（P＜0.05）。在采集的豫南黑猪各组织中，H-FABP基因在肝、肺和肾中表达量很低，皮脂中H-FABP基因的表达量最高，约为肺脏的882.2倍（P＜0.05）；H-FABP基因在三元杂交猪皮脂中的表达量是肾脏组织表达量的501.6倍（P＜0.05）。豫南黑猪心脏、脾脏、肾和皮下组织中H-FABP基因转录水平高于三元杂交猪，其中脾脏组织H-FABP的表达量约为三元杂交猪的6.8倍（P＜0.05），而三元杂交猪肺脏、肝脏和腹部脂肪H-FABP表达量高于豫南黑猪，其中腹部脂肪组织H-FABP的表达量约为豫南黑猪的2.7倍（P＜0.05）。

表1 Real-time PCR引物及其反应条件

表2 IGF2基因的差异性表达

表3 H-FABP基因差异性表达

2.3 RPL9基因的差异性表达 由表4可知，在豫南黑猪各组织中， RPL9基因在脾脏的表达量最低，在皮脂与腹脂中表达量最高，各组织间表达量差异不大，皮脂仅为脾脏的9.0倍（P＜0.05）；而在三元杂交猪各组织中，RPL9基因在心脏和肾脏的表达量最低，皮脂中RPL9基因的表达量最高（P＜0.05）。RPL9基因在豫南黑猪心、肝、肺和肾组织中表达量高于三元杂交猪，其中肝脏组织RPL9的表达量约为三元杂交猪的3.1倍（P＜0.05）；在脾脏、皮下脂肪和腹部脂肪中表达量低于三元杂交猪内表达量，其中皮脂中的表达量差异最大，三元杂交猪约为豫南黑猪的4.9倍（P＜0.05）。

表3 RPL9基因差异性表达

3 讨 论

IGF2是胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor, IGF）家族重要成员之一。猪IGF2基因定位于2号染色体，由23 821个核苷酸组成，具有4个启动子（P1～P4大小分别为945、866、784 、64 bp），IGF2基因可转录出7种 mRNA，翻译出由181个氨基酸组成的蛋白前体，经过成熟后变成具有157个氨基酸序列的IGF2。在猪胚胎期的脂肪组织、肌肉组织的发育过程中均有大量的IGF2表达，认为IGF2基因与其发育密不可分[5]。猪IGF2基因具有表达组织特异性，在肌肉和肾脏中表达父本性等位基因，而在肝脏、大脑等其他组织当中则表达2个等位基因。Laore等[6]研究发现，IGF2基因启动子区域的突变与肌间脂肪含量具有明显的相关性，这一突变可能增加3%～4%的瘦肉；且IGF2基因的表达量在高肌间脂肪含量和低肌间脂肪含量的样品中存在显著差异，是瘦肉增长的主效基因[7-8]。由荧光定量PCR实验结果可知，2种猪体内IGF2的表达模式类似，但豫南黑猪各组织中IGF2的表达量基本都远高于三元杂交猪，尤其在皮下脂肪和腹部脂肪2个组织中差异显著，此结果与唐中林等[9]和冯诚诚等[10]实验结果一致，共同证明了本地品种的IGF2表达量远高于外来品种，相关原因需要进行深入的研究和探索。

脂肪酸结合蛋白（Fatty Acid Binding Proteins, FABPs）包括多个蛋白质，其中心型脂肪酸结合蛋白（Heart Fatty Acids Binding Protein, H-FABP）和脂肪组织脂肪酸结合蛋白（Adipocyte Fatty Acids Binding Protein, A-FABP）是目前研究发现的与IMF沉积关系最密切的2个蛋白质。猪H-FABP基因位于第6号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，被证明是IMF沉积的主效基因[11-12]。H-FABP基因可以在心脏、肾脏、肺脏、大脑、胎盘、卵巢以及平滑肌等组织中表达，但其主要表达部位是对脂肪酸需求较大的骨骼肌、乳腺和心肌。H-FABP基因在细胞转运、脂肪细胞分化、生长抑制和脂肪沉积方面都有重要的作用，H-FABP基因和脂酰辅酶A、酰基-L-肉碱共同作用，参与脂质的代谢过程。庞卫军等[13]通过对西部地区的猪种和野猪的研究发现，同种猪的不同基因型间IMF含量存在差异，实验中分为9种基因型，各基因型对IMF含量的影响不同：HH＞Hh＞hh、DD＜Dd＜dd、AA＜Aa＜aa，可以通过提高“aa-dd-HH”基因型频率来提高IMF的含量，继而改善猪肉品质[14]。本实验中，H-FABP基因在皮下脂肪中的表达量最高，远高于其他组织，证明该基因与脂肪沉积有着极为密切的关系；而H-FABP在豫南黑猪和杜×大×长三元杂交猪体内各组织的表达模式却不尽相同，推测该基因可能是影响不同猪种肉质不同的主效基因之一。

核糖体蛋白（Ribosomal Protein，RP）存在于真核细胞中，是一种RNA结合蛋白，源自于核糖体的各种大亚基和小亚基，主要有RPL和RPS 2种类型。核糖体蛋白L9（RPL9）作为核糖体大亚基的一部分，结构复杂，能与23S RNA相互作用。有研究表明，RPL9基因有调节动物生长发育的作用，并在一定程度上促进细胞增殖、分化等，但是其具体作用机制尚不明确[15]。RPL9基因被认为是影响肉质性状的重要候选基因，该基因可在动物不同生长发育阶段对脂肪的沉积起调节作用，从而影响肉质品质。张晶等[16]研究表明，RPL9基因可能对细胞分化的调控和脂肪酸代谢的平衡产生影响，进而影响脂肪沉积。李霞等[17]研究发现，RPL9基因可能为脂肪沉积相关基因。本研究发现，虽然在其他组织中RPL9基因的表达量均为豫南黑猪高于三元杂交猪，但豫南黑猪皮下脂肪和腹部脂肪中RPL9基因的表达量远低于杜×大×长三元杂交猪，由此可以推测该基因对脂肪沉积有一定的调控作用。由于此结果与IGF2表达量的结果截然不同，推测RPL9的作用机理可能与IGF2正好相反。

4 结 论

本实验结果显示，豫南黑猪各组织中IGF基因的表达量基本都远高于三元杂交猪，尤其在皮下脂肪和腹部脂肪2个组织中差异显著；H-FABP基因在豫南黑猪和杜×大×长三元杂交猪的皮下脂肪中表达量最高，远高于其他组织；豫南黑猪皮下脂肪和腹部脂肪中RPL9基因的表达量显著低于杜×大×长三元杂交猪，揭示不同猪脂肪沉积和肥胖程度差异受遗传因素影响很大，这可为进一步探讨影响肉质的遗传因素提供理论依据。随着对相关基因不断深入的研究，可通过基因调控技术提升或降低目的基因在各个组织的表达量，从而在分子水平上控制肌肉及脂肪的性状，以期达到改善猪肉品质的目标，这对提高畜禽养殖业品质和经济效益都有着重要的意义。

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Dif f erentially Expressions of IGF2、H-FABP and RPL9 Genes in Yunan Black Pig and Three Breed Hybrid Pigs

BAI Lu, JING Ya-xing, FENG Shuo, SUN Gang, ZHENG Zhen-yu*

This experiment was conducted to study the dierentially expressions oIGF2, H-FABP and RPL9 genes in dierent tissues between the yunan black pig and the three breed hybrid pig and analyzed the dierences ogene expression between dierent pigs. The yunan black pig and the” Duroc × large white × Landrace” three breed hybrid pig, weighing an average o70 kg, were randomly chosen to obtain the heart, liver, spleen, lung, kidney, abdominalat and back subcutaneousator total RNA extraction anduorescence quantitative PCR test othe IGF2, H-FABP and RPL9 gene. The results showed that the expression dierences oIGF2 in heart, liver, spleen tissues oyunan black pig were especially obvious that it othe yunan black pig were about 225.0 times othe three breed hybrid pig (P＜0.05). The transcription levels of H-FABP in the yunan black pig heart, spleen, and subcutaneous tissues were higher than those in the three breed hybrid pig, which the expression in spleen tissue othe yunan black pig was about 6.8 times othe three breed hybrid pig (P＜0.05), while the expressions in lung and abdomenat othe three breed hybrid pig were higher, that H-FABP expression in abdomenat othe three breed hybrid pig was about 2.7 times othe yunan black pig (P＜0.05). The expressions oRPL9 in heart, liver, lung and kidney tissues othe yunan black pig were higher and the expression dierence in subcutaneousat was largest, which o.the three breed hybrid pig was about 4.9 times that othe yunan black pig (P＜0.05). These results indicated that the expression dierences othe IGF2、H-FABP and RPL9 gene in dierent tissues between the yunan black pig and the three breed hybrid pig were signicant.

Yunan black pig; Three breed hybrid pig; IGF2; H-FAB; PRL9; Fat deposition

S828.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-040

2016-06-07；

2016-11-15

白鹭（1993-），女，河南新乡人，硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖方面的研究，E-mail: 277103133@qq.com

*通讯作者：郑振宇（1962-），男，吉林龙井人，教授，主要从事动物繁殖学和动物遗传工程方面的研究，E-mail: cbuniv @126.com