系统性红斑狼疮患者CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1表达的临床意义

杨 舟 詹 锋 林书典 符克英

(海南省人民医院肾病风湿科,海南 海口 570000)

系统性红斑狼疮患者CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1表达的临床意义

杨 舟 詹 锋 林书典 符克英

(海南省人民医院肾病风湿科,海南 海口 570000)

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)及转化生长因子(TGF)-β1表达的临床意义。方法 SLE患者88例，其中活动期者35例(活动组)，稳定期25例(稳定组)，肾病期28例(肾病组)，另选同期在医院实施健康体检的志愿者30例为对照组，检测并对比各组CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平，各组SLE病情活动度积分(SLEDAI)、红细胞沉降率(ESR)及补体C3水平，分析指标间的相关性。结果 肾病组及活动组CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平均明显低于稳定组和对照组，且肾病组明显低于活动组(均P<0.05)。肾病组及活动组SLEDAI积分及ESR水平明显高于稳定组和对照组，补体C3水平明显低于稳定组和对照组，且肾病组SLEDAI积分及ESR水平明显高于活动组，补体C3水平明显低于活动组(均P<0.05)。根据Spearman相关性分析，患者CD4+CD25+Treg及TGF-β1与SLEDAI积分和ESR均呈负相关，与补体C3呈正相关。结论 SLE患者CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平可随疾病的进展而下调表达，且可以预测患者病情进展。

系统性红斑狼疮；CD4+CD25+调节性T细胞；转化生长因子-β1

系统性红斑狼疮(SLE)属于自身免疫性炎症类型的结缔组织疾病，高发于中青年女性人群，可累及身体多个脏器。该病的发病原因目前尚不明确，报道指出内分泌以及免疫异常等在发病过程中十分重要，其中调节性T细胞(Treg)出现数量缺失以及功能缺陷等可作为SLE发生发展的关键性因素。研究发现〔1〕，CD4+CD25+Treg在确保机体免疫耐受方面发挥重要作用，如其本身免疫耐受遭到破坏，则会致使机体出现免疫性疾病。而转化生长因子(TGF)-β1作为CD4+CD25+Treg的一种细胞因子，同样具有高免疫调节功能，对自身免疫性疾病的发病产生重要影响。有报道指出〔2〕，CD4+CD25+Treg及TGF-β1可能同SLE的发病存在一定关系。本文拟分析SLE患者CD4+CD25+Treg及TGF-β1表达的临床意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选择从2014年1月至2016年6月在医院诊治的SLE患者88例。其中男16例，女72例，年龄42～74〔平均(53.67±12.14)〕岁。入选标准：(1)患者均已符合1982年时美国的风湿病学会(ARA)制定的SLE诊断标准〔3，4〕；(2)年龄>40岁。排除标准：(1)其他种类的免疫性疾病；(2)存在原发性肾疾病；(3)血液类疾病；(4)恶性肿瘤。88例患者中，处于疾病活动期者35例(活动组)，男6例，女29例；年龄42～72〔平均(53.55±11.29)〕岁。稳定期25例(稳定组)，男4例，女21例；年龄43～71〔平均(54.01±10.68)〕岁。肾病期28例(肾病组)，男6例，女22例；年龄45～74〔平均(53.60±11.33)〕岁。其中肾病组以符合下列条件的任意1项以上进行评定。(1)蛋白尿>0.5 g/24 h；(2)管型(表现为红细胞或血红蛋白，即颗粒管型，亦或是混合管型)；(3)经肾活检明确为狼疮肾炎，且病理变化根据WHO分类标准评定为≥Ⅱ型。另选同期在医院实施健康体检的志愿者30例作为对照组，男5例，女25例，年龄42～75〔平均(53.62±12.03)〕岁。各组年龄及性别等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已获得患者的签字知情，且医院的伦理委员会也已审批通过。

1.2 研究方法 对各组受试者分别抽取其晨间的空腹外周静脉血约4 ml装入2支试管各2 ml，其中1支为肝素抗凝管为管①，另1支分离血清为管②，3 000 r/min离心15 min后提取血清，置于-20℃的冰箱内保存待测。利用美国贝克曼公司生产的FACS Calibur 流式细胞仪及2支仪器专用试管分别添加100 μl的全血标本，为管①加入IgG1-PE及IgG1-FITC各20 μl，为管②加入CD4-PE及CD25-FITC 各20 μl，经振荡器混匀后，在室温下进行15 min的避光反应，再添加1 ml的溶血素，于室温下避光约20 min。而后添加2 ml的磷酸盐缓冲液(PBS)，3 000 r/min离心15 min之后弃去上清液，添加500 μl 1%的多聚甲醛使细胞重悬。之后上机测定CD4+CD25+Treg比率。检测时需根据前向散射及侧向角散射的光信号为淋巴细胞群作好设门操作，在每份标本中获取设门中的10 000个细胞，将检测数据通过listmode文件保存。利用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清TGF-β1水平。再常规检测红细胞沉降率(ESR)及补体C3等疾病活动性相关指标。上述试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司，操作过程中应严格遵守说明书的步骤进行操作。

1.3 观察指标 对比各组CD4+CD25+Treg及TGF-β1，各组SLE病情活动度积分(SLEDAI)、ESR及补体C3水平，分析指标间的相关性。其中SLEDAI积分表共24项〔5〕，得分0～4分表明SLE疾病无活动；5～9分表明SLE疾病有轻度活动；10～14分表明SLE疾病有中度活动；≥15分表明SLE疾病有重度活动。分值越高提示SLE患者的疾病症状越严重。

1.4 统计学方法 应用SPSS21.0软件进行χ2、t检验、方差分析和Spearman法。

2 结 果

2.1 各组CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平比较 肾病组及活动组CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平均明显低于稳定组和对照组，且肾病组均明显低于活动组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组CD4+CD25+ Treg及TGF-β1水平比较

与对照组比较:1)P<0.05；与稳定组比较:2)P<0.05；与活动组比较:3)P<0.05；下表同

2.2 各组SLEDAI积分、ESR及补体C3水平比较 肾病组及活动组SLEDAI积分及ESR水平明显高于稳定组和对照组，补体C3水平明显低于稳定组和对照组，且肾病组的SLEDAI积分及ESR水平明显高于活动组，补体C3水平明显低于活动组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组SLEDAI积分、ESR及补体C3水平比较

2.3 相关性分析 CD4+CD25+Treg及TGF-β1与SLEDAI积分和ESR均呈负相关(r=-0.671，-0.693；-0.724，-0.680；均P<0.05)，与补体C3呈正相关(r=0.704，0.712；均P<0.05)。

3 讨 论

SLE会导致患者皮肤出现特异性皮损，并引起骨骼以及肌肉疼痛，同时还会累及呼吸系统以及肾脏等系统。初步研究其发病机制发现〔6〕，患者在遗传及环境等因素的共同作用下，发生T淋巴细胞水平下降以及T抑制细胞自身功能水平的下降等现象，并释放出大量自身性抗体，同机体相关抗原相结合，进而生成免疫复合物，在患者皮肤、关节及肾小球等位置沉积。目前研究认为〔7〕，SLE疾病的发生主要和T细胞所介导的自身性免疫反应直接相关，且其中CD4+CD25+Treg占主导地位。同时，TGF-β1作为CD4+CD25+Treg的一项重要转化类细胞因子，具有控制维护机体免疫平衡以及改善免疫耐受等功能，其表达与SLE发病及病情发展之间的关系同样已受到临床高度关注。

本研究符合Tselios等〔8〕的报道结果，提示SLE患者的病情进展与CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平联系紧密。可能是因为CD4+CD25+Treg及TGF-β1的变化主要受到患者机体的免疫异常影响，而SLE疾病作为一类免疫系统性疾病，其进展更易影响上述指标的变化。詹淑霞等〔9〕报道，Treg对机体反应性T细胞的自身生成和活化以及增殖等活动均可发挥较好的调控作用。同时，其还可帮助维护机体免疫功能的正常状态，确保外周免疫功能的正常。其中CD4+CD25+Treg可对机体受损之后所发生的免疫反应进行调控，如机体出现CD4+CD25+Treg水平下降的情况，则会直接导致机体出现自身性免疫类疾病，而目前已证实SLE属于此类疾病，患者的确存在Treg数量缺失以及功能缺陷等情况〔10〕。TGF-β1在机体中的生成来源很广，其可由各类淋巴细胞及巨噬细胞等多种细胞进行合成及分泌而成，但是Treg在所有淋巴细胞中所占的比例不足5%，且对于SLE患者而言其所具有的Treg水平更低。具体而言，SLE患者体内TGF-β1水平下降导致Treg生成水平大幅度下降，进而降低患者的免疫耐受力，最终造成SLE的发生和发展。同时，本研究结果还符合张晓莉等〔11〕的报道，提示随着SLE患者疾病的进展程度加剧，其SLEDAI积分及ESR、补体C3水平均出现了明显异常。主要是因为SLEDAI积分自身即是衡量SLE病情活动度的一个评分量表，而ESR及补体C3可对SLE患者的病情作出生化指标的直观性呈现，因此SLEDAI积分及ESR、补体C3在SLE患者疾病进展的情况下，分别表现出了相应的变化。本文Spearman分析再次证实了SLE患者病情的进展与上述指标之间均存在较大关联。其原因可能由于CD4+CD25+Treg数量下降，造成机体内自身反应型淋巴细胞受抑制的作用降低，影响了免疫功能，致使TGF-β1水平受到影响，进而推进SLE的发展进程，并反过来影响患者的SLEDAI积分、ESR及补体C3水平〔12〕。

1 张 莉，孙 静，沈 洁，等.狼疮定对SLE CD4+T细胞凋亡及其GRα表达的作用〔J〕.浙江中医药大学学报，2016；40(6)：423-30.

2 Comte D，Karampetsou MP，Kis-Toth K，etal.Engagement of SLAMF3 enhances CD4+ T-cell sensitivity to IL-2 and favors regulatory T-cell polarization in systemic lupus erythematosus〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2016；113(33)：9321-6.

3 赵书山，王 健，厉伟民，等.初发系统性红斑狼疮患者CD4+CD25+CD127low/-T细胞可能具有效应T细胞特点的研究〔J〕.医学研究杂志，2013；42(9)：109-13.

4 Ferreira-Vda S，Mesquita FV，Mesquita DJ，etal.The effects of freeze/thawing on the function and phenotype of CD4(+)lymphocyte subsets in normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Cryobiology，2015；71(3)：507-10.

5 李吴萍，王海英，杨 霞，等.影响系统性红斑狼疮活动指数评分的主要指标分析〔J〕.中华风湿病学杂志，2012；16(5)：343-5.

6 Wang Q，Qian S，Li J，etal.Combined transplantation of autologous hematopoietic stem cells and allogenic mesenchymal stem cells increases T regulatory cells in systemic lupus erythematosus with refractory lupus nephritis and leukopenia〔J〕.Lupus，2015；24(11)：1221-6.

7 赵宏丽，赵俊芳，李孟娟，等.系统性红斑狼疮患者CD4+CD25+调节性T细胞及其细胞因子的改变〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2012；26(7)：581-3.

8 Tselios K，Sarantopoulos A，Gkougkourelas I，etal.Increase of peripheral T regulatory cells during remission induction with cyclophosphamide in active systemic lupus erythematosus〔J〕.Int J Rheum Dis，2014；17(7)：790-5.

9 詹淑霞，陈 路，陆东庆，等.CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1与系统性红斑狼疮病情活动性关系的研究〔J〕.临床和实验医学杂志，2012；11(4)：250-1，253.

10 刘玉华，陈兆军，韩 杰，等.CD86嵌合抗体对系统性红斑狼疮患者自身反应性B细胞的作用及影响研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，2016；36(7)：481-6.

11 张晓莉，徐胜前，蔡 静，等.补体C3水平与系统性红斑狼疮疾病活动强度的关系研究〔J〕.中华全科医师杂志，2016；15(5)：375-8.

12 Tselios K，Sarantopoulos A，Gkougkourelas I，etal.The influence of therapy on CD4+CD25(high)FOXP3+ regulatory T cells in systemic lupus erythematosus patients：a prospective study〔J〕.Scand J Rheumatol，2015；44(1)：29-35.

〔2017-03-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

詹 锋(1962-)，男，主任医师，主要从事风湿免疫性疾病及肾脏病研究。

杨 舟(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事风湿免疫性疾病研究。

R593.24

A

1005-9202(2017)13-3305-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.085