丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织和心律失常的保护作用

李 涛 袁春桃

(邵阳学院教务处，湖南 邵阳 422000)

丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织和心律失常的保护作用

李 涛 袁春桃1

(邵阳学院教务处，湖南 邵阳 422000)

目的 探讨丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织和心律失常的保护作用。方法 健康Wistar大鼠30只，采用随机数字表法分为5组，假手术组、模型组、丹参酮ⅡA高剂量(20 mg·kg-1·d-1)、中剂量(10 mg·kg-1·d-1)、低剂量组(5 mg·kg-1·d-1)，假手术组和模型组给予生理盐水，高、中、低剂量3组分别给予相应药物灌胃7 d，末次给药2 h后，除假手术组外均进行心肌缺血的造模，记录各组大鼠的心律失常评分、T波变化及心肌组织缺血修饰白蛋白(IMA)、心型脂肪酸结合蛋白(H-FBAP)及心肌细胞凋亡相关基因蛋白的表达情况。结果 5组实验大鼠的IMA、H-FABP、Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值差异均显著(P<0.05)；假手术组、丹参酮ⅡA高剂量组、丹参酮ⅡA中剂量组的IMA显著低于模型组(P<0.05),假手术组、丹参酮ⅡA高剂量组H-FABP显著高于模型组(P<0.05)，假手术组、丹参酮ⅡA高剂量组、丹参酮ⅡA中剂量组、丹参酮ⅡA低剂量组Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值均显著高于或低于模型组。5组实验大鼠的心律失常评分、缺血再灌注T波变化幅度差异显著(P<0.05)；模型组大鼠的心律失常评分〔(4.28±1.06)分〕，显著低于假手术组、丹参酮ⅡA高剂量组和丹参酮ⅡA中剂量组(P<0.05)；模型组缺血再灌注T波变化幅度(0.447±0.027)mv显著高于假手术组、丹参酮ⅡA高剂量组、丹参酮ⅡA中剂量组和丹参酮ⅡA低剂量组(P<0.05)。结论 丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织和心律失常具有保护作用，其作用机制可能与抑制IMA、Bax蛋白升高、H-FBAP及Bcl-2蛋白降低有关。

丹参酮ⅡA；缺血再灌注损伤；心肌组织；心律失常

发生缺血性心脏病后，尽早恢复心肌供血是减轻损伤的基本措施，但缺血后再灌注可对心肌造成损伤，甚至引发心律失常，是心肌梗死患者早期死亡的主要原因〔1〕。自心肌缺血再灌注损伤的概念首次被提出后〔2〕，对损伤的发生机制及预防、治疗措施的探索一直受医学界重视。近年来，中药在抗心律失常方面的研究取得了很大的进展，其中以中药丹参为主要成分的丹参片、复方丹参滴丸等药物一直位列一线药物。本文观察丹参酮ⅡA对缺血再灌注大鼠心律失常评分、T波变化及心肌组织缺血修饰白蛋白(IMA)、心型脂肪酸结合蛋白(H-FBAP)表达情况的影响，探讨丹参酮ⅡA 减轻缺血再灌注心律失常的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物级分组 健康雄性Wistar大鼠30只，体重250～300 g，平均(273±13.6) g；采用随机数字表法分为5组，假手术组、模型组、丹参酮ⅡA高剂量(20 mg·kg-1·d-1)、中剂量(10 mg·kg-1·d-1)、低剂量组(5 mg·kg-1·d-1)。

1.2 造模及给药方法 5组大鼠于实验前7 d开始进行适应性喂养，假手术组和模型组给予生理盐水，丹参酮ⅡA高、中、低剂量分别按20、10、5 mg·kg-1·d-1标准灌胃7 d，末次给药4 h后，除假手术组不采取冠脉结扎外，其余4组大鼠结扎冠状动脉左前降支15 min后松开使再灌注30 min制备模型。

1.3 仪器与试剂 LD4-2型离心机(北京医用离心机厂),江湾Ⅰ型微型人工呼吸机,ZS83-1型内切式组织匀浆器(浙西机械厂)，XD-30C三道心电图机(上海医用电子仪器厂)，ERM-4000石蜡切片机，徕卡EG1150组织包埋机，Olympus光学显微镜，RM6240B 型多通道生物信号采集处理系统，DHC-1020电热恒温水槽，梅特勒AB104-S型万分之一电子天平，心肌组织IMA、H-FABP试剂盒，Bcl-2蛋白抗体，Bax蛋白抗体(美国ADL公司)，DAB显色试剂盒。

1.4 指标检测方法 实验结束后取大鼠左心室心肌，经预冷的生理盐水洗涤后-80℃保存备用，检测时取0.2 g心肌组织剪碎后加入4倍体积的裂解液，匀浆提取心肌组织总蛋白，然后转入EP管，4℃静置0.5 h，12 000 r/min、4℃离心 30 min，取上清按Bradford法进行蛋白质定量，IMA、H-FABP水平定量检测采用双抗体两步夹心ELISA法,IMA检测灵敏度为1.0 mg/ml，H-FABP检测灵敏度为0.01 ng/ml。

1.5 左心室心肌组织Bcl-2和Bax蛋白检测 再灌注2 h结束后，迅速取下左冠状动脉降支支配的左心室心肌，放置于10%甲醛溶液中进行固定24 h之后行常规石蜡包埋，进行切片，测定Bax和Bcl-2基因蛋白表达水平，封片结束后，在光学显微镜下观察(400倍)，采用高清晰HAIPS-2000凸显分析系统测定每周光密度值。

1.6 心律失常评分方法 无心律失常或者有，但是<5次的室性前期收缩，计0分；仅有≥5次的室性前期收缩，计1分； 有一阵<60 s的室性心动过速，计2分；有一阵≥60 s的或多阵累计<60 s的室性心动过速，计3分；多阵室性心动过速累计>60 s，计4分；出现室颤，计5分；出现持续5 min以上的室颤或在观察期间死亡，计6分。模型组只计算再灌注期30 min内发生的心律失常。手术结束后处死动物取左心室，-80℃保存备用。记录大鼠缺血15 min后再灌注30 min的心电图变化情况，测量T波抬高或降低的情况。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 各组心肌缺血再灌注损伤指标水平 各组IMA、H-FABP、Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值差异显著(P<0.05)；假手术组、丹参酮ⅡA高、中剂量组的IMA显著低于模型组(P<0.05),假手术组、丹参酮ⅡA高剂量组的H-FABP显著高于模型组(P<0.05)，假手术组、丹参酮ⅡA高、中、低剂量组的Bcl-2 OD值、Bax OD值、Bcl-2/Bax值均显著高于或低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心肌缺血再灌注损伤指标水平比较±s)

与模型组比较：1)P<0.05；与假手术组比较:2)P<0.05；与丹参酮ⅡA高剂量组比较：3)P<0.05；与丹参酮ⅡA中剂量组比较:4)P<0.05,下表同

2.2 各组心律失常指标比较 各组心律失常评分、缺血再灌注T波变化幅度差异显著(P<0.05)；模型组心律失常评分显著高于假手术组、丹参酮ⅡA高、中、低剂量组(P<0.05)；模型组缺血再灌注T波变化幅度显著高于假手术组、丹参酮ⅡA高、中和低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组心律失常指标变化情况±s，n=6)

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤的概念被提出〔2〕，对损伤的发生机制及预防、治疗措施的探索一直受医学界重视〔3〕。临床研究逐渐认识到心肌缺血再灌注损伤的发生过程十分复杂，简要过程大致如下：心肌细胞缺血→胞内Ca2+浓度升高→细胞膜Na+/H+交换系统被激活→胞内Na+浓度升高→Na+/Ca2+交换系统被激活，导致Ca2+大量进入细胞→磷脂酶被激活→产生氧自由基；大量Ca2+移向线粒体导致线粒体功能障碍→引起心律失常。

正常人体中并不存在IMA，但当心肌缺血时，一系列生化指标的改变导致血液白蛋白(HSA)氨基末端N受损或被Cu2+结合，或受游离羟基的损害使氮基末端2～4个氨基酸改变成为IMA，在心肌缺血5～10 min后血中IMA即可升高，缺血停止后可持续2～4 h，12 h后恢复正常。冠心病患者经皮冠状动脉介入治疗也可导致血液循环IMA中水平一过性升高；脂肪酸结合蛋白(FABP)是一种特异性存在于心肌细胞胞质内的游离脂肪酸的运载体，H-FABP是这种小分子蛋白的一种亚型，这种小分子蛋白的作用是将游离脂肪酸转运至线粒体，因而是心肌收缩的主要能量来源，在发生心肌缺血后，H-FABP分子由于心肌细胞膜通透性增加而从心肌细胞大量流失，从而导致心肌细胞能量代谢物质缺乏，加重心肌受损。Bcl-2蛋白是一种存在于膜细胞器的膜整合蛋白家族，成员中如Bax、Bid 等发挥促进细胞凋亡作用，Bcl-2、Bcl-x等发挥抑制细胞凋亡作用。有研究证实Bcl-2过度表达有较强的抗大鼠心肌凋亡作用，但Bcl-2表达在缺血再灌注时显著下降，因而凋亡指数升高，研究还发现在人体心肌缺血再灌注中试验中，细胞凋亡蛋白Bax表达随时间延长而增加〔4〕。本研究丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤及再灌注心肌细胞损伤具有良好的保护作用，与文献相符〔5,6〕,其作用机制可能与其减轻炎症反应、抑制钙超载、活化内皮一氧化氮合酶/一氧化氮途径减少心肌梗死面积等有关〔7～11〕，至于其更多的药理机制尚需进一步研究。

1 韩 迪.丹参酮ⅡA对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响研究〔J〕.现代预防医学,2011；38(13):2572-4.

2 周 倩.丹参酮ⅡIA 对急性心肌缺血室性心律失常的影响〔D〕.武汉：华中科技大学，2013.

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4 黄宜生,贾钰华,孙学刚,等.酸枣仁皂苷A对缺血再灌注损伤大鼠心律失常及Bcl-2、Bax表达的影响〔J〕.中药新药与临床药理,2011；22(1):51-4.

5 Jang TS,Zhang H,Kim G,etal.Bioassay-guided isolation of fatty acid synthase inhibitory diterpenoids from the roots of Salvia miltiorrhiza Bunge〔J〕.Arch Pharm Res,2012；35(3):481-6.

6 Chuang MT,Ho FM,Wu CC,etal.15,16-dihydrotanshinone I,a compound of Salvia miltiorrhiza bunge,induces apoptosis through inducing endoplasmic reticular stress in human prostate carcinoma cells〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med,2011；2011(5)：865435.

7 Xu M,Cao FL,Lin NY,etal.Tanshinone ⅡA reverses the malignant phenotype of SGC7901 gastric cancer cells〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2013；14(1):173-7.

8 Ren ZH,Tong YH,Xu W,etal.Tanshinone Ⅱ A attenuates inflammatory responses of rats with myocardial infarction by reducing MCP-1 expression〔J〕.Phytomedicine,2010；17(3-4):212-8.

9 Ren G,Dewald O,Frangogiannis NG.Inflammatory mechanisms in myocardial infarction〔J〕.Curr Drug Targets Inflamm Aller,2003；2(3):242-56.

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11 Pan C,Lou L,Huo Y,etal.Salvianolic acid B and tanshinone ⅡA attenuate myocardial ischemia injury in mice by NO production through multiple pathways〔J〕.Ther Adv Cardiovasc Dis,2011；5(2):99-111.

〔2015-07-14修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

湖南省教育厅科学研究项目(No.17C1431)；邵阳市科技计划项目(2015NC53)

袁春桃(1982-)，女，主治医师，主要从事心血管系统疾病基础与临床研究。

李 涛(1980-)，男，讲师，主要从事心血管药理研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)13-3154-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.014

1 邵阳市中心医院