新疆地区老年真菌性角膜炎致病镰刀菌的基因型和体外药物敏感性

魏 华 杨 炜 赵新荣 樊凌花 王 娟

(石河子大学医学院第一附属医院眼科，新疆 石河子 832008)

新疆地区老年真菌性角膜炎致病镰刀菌的基因型和体外药物敏感性

魏 华 杨 炜 赵新荣 樊凌花 王 娟

(石河子大学医学院第一附属医院眼科，新疆 石河子 832008)

目的 研究新疆地区老年真菌性角膜炎分离镰刀菌的基因型和药物敏感性。方法 老年真菌性角膜炎患者角膜中分离得到的镰刀菌758株，采用部分EF1-α基因序列比对鉴定镰刀菌菌种和基因型；采用CLSI研究所M38方案测定鉴定出的镰刀菌对两性霉素B、氟康唑等11种常用抗真菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果 758株镰刀菌中经EF1-α基因序列共鉴定出644株，本地区以腐皮镰刀菌种复合体(FSSC)最多，共包括15个菌种，43个基因型，最常见基因型为FSSC5-d。赤霉菌种复合体(GFSC)位居第2，有3个菌种；尖孢镰刀菌复合体(FOSC)位居第3，有6个基因型。植物性外伤、眼部手术引起的外伤GFSC角膜炎发生率明显高于FSSC角膜炎(P<0.01)。物理、化学因素引起的外伤GFSC角膜炎发生率明显低于FSSC角膜炎(P<0.05)。体外药敏试验显示，镰刀菌对那他霉素、两性霉素B、伏立康唑敏感；对5-FC、制霉菌素、咪康唑、克霉唑耐药；FSSC感染的真菌性角膜炎对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的MIC50高出GFSC约2倍。结论 新疆地区老年真菌角膜炎患者中感染镰刀菌主要位于3个复合体FSSC、GFSC、FOSC中；植物性外伤、眼部手术易引起GFSC角膜炎，物理、化学因素外伤易引起FSSC角膜炎；不同种镰刀菌对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的药敏有差异。

真菌性角膜炎；镰刀菌；基因型；药物敏感性

真菌性角膜炎是一种发病率较高的致盲性角膜疾病，18%～25%的真菌性角膜炎患者因病情恶化需接受角膜移植等外科手术治疗〔1〕。我国以镰刀菌属为主。镰刀菌属菌种数量多，形态差异明显，传统形态学鉴定将该菌属分为22个型，65个种，50个变种，由于该方法主要通过种间细微差异来鉴定，由于镰刀菌生长中发生的变异可影响鉴定的准确性〔2〕。近年来研究发现镰刀菌EF1-α、ITS、β-tubulin等基因并以EF1-α基因编码蛋白翻译机制为必要组成，有学者以此为依据设计出镰刀菌属的通用引物，对比其基因序列，可快速准确地鉴定镰刀菌种〔3〕。本次研究拟分析老年患者外伤史等危险因素与镰刀菌基因型的关系，测定镰刀菌体的抗真菌药物敏感性。

1 资料与方法

1.1 实验菌株 新疆石河子大学医学院第一附属医院眼科自2011年1月至2015年12月收治的来自省内各地区的老年真菌性角膜炎患者角膜中分离的镰刀菌株758株。标准对照为2010年从我国普通微生物菌种保护中心购买的腐皮镰刀菌、串珠镰刀菌各1株。

1.2 镰刀菌DNA提取 将4℃保存的镰刀菌转移接种到含葡萄糖的马铃薯琼脂固态培养基中，在27℃～30℃环境下培养1 w，之后转移到含葡萄糖的马铃薯液态培养基中，27℃～30℃环境下培养6～7 d后得到菌丝。菌丝经液氮研磨处理后，用微生物DNA提取试剂盒(北京博奥拓达科技有限公司)提取总DNA，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 PCR扩增及测序 镰刀菌EF1-α基因的PCR引物序列合成由北京百奥莱博科技有限公司完成。选用50 μl PCR反应体系，具体为：镰刀菌DNA样本2 μl，引物1、引物2分别1 μl，PCR Master Mix(上海北诺生物科技有限公司)25 μl。将扩增出的阳性产物送至北京百奥莱博科技有限公司测定序列。

1.4 外伤史及药敏测定 调查基因鉴定为阳性患者的外伤史。选用CLSI研究所M38方案对分离出的镰刀菌行药敏测定，质控为ATCC10231光滑念珠菌。采用DMEM培养基，将两性霉素B、氟康唑、制霉菌素等12种常用的抗真菌药物进行倍比稀释，96孔板每孔加入100 μl。将分离出的菌株转种到培养基中，调整菌液浓度至1.0×104～5.0×104个/ml。96孔板每孔加入菌液100 μl，27℃环境中培养48 h后观察，计算50%、90%菌株的最低抑菌浓度(MIC50、MIC90)。

1.5 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1 镰刀菌基因型检测结果 758株镰刀菌中EF1-α基因序列共鉴定出644株(84.96%)。阳性EF1-α基因序列比对显示该基因存在较好的多态性，与FUSARIUM数据库中的菌株基因序列之间的一致性大于99%。99.38%的镰刀菌株鉴定为腐皮镰刀菌种复合体(FSSC)、赤霉菌种复合体(GFSC)、尖孢镰刀菌复合体(FOSC)，0.62%鉴定为FUSARIUM SP，其中以FSSC最多(386株，59.94%)，有15个菌种，43个基因型，最常见基因型为FSSC5-d，其次为FSSC3+4-eee；GFSC位居第2位(246株，38.20%)包括：F.proliferstum、F.veryicillioides、GFSC 3个菌种；FOSC位居第3位(12株，1.86%)，包括6个基因型。见表1。

2.2 外伤史与FSSC和GFSC感染的真菌性角膜炎关系 有外伤原因的真菌性角膜炎中，植物性外伤、眼部手术引起的外伤GFSC角膜炎发生率明显高于FSSC角膜炎(P<0.01)。物理、化学因素引起的外伤GFSC角膜炎发生率明显低于FSSC角膜炎(P<0.05)。见表2。

2.3 镰刀菌的药敏试验 644株镰刀菌体外药敏试验显示，全部镰刀菌对那他霉素(MIC50、MIC90分别为2、3 mg/L)、两性霉素B(MIC50、MIC90分别为2、3 mg/L)、伏立康唑(MIC50、MIC90分别为2～4 mg/L)敏感；50%以上的镰刀菌对酮康唑、益康唑、伊曲康唑、特比萘芬敏感，MIC50、MIC90均为2、4 mg/L；镰刀菌对5-FC(MIC50、MIC90分别为12、16 mg/L)、制霉菌素(MIC50、MIC90分别为16、32 mg/L)、咪康唑(MIC50、MIC90分别为8、16 mg/L)、克霉唑(MIC50、MIC90分别为8、16 mg/L)不敏感。FSSC感染的真菌性角膜炎对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的MIC50高出GFSC约2倍。

表1 新疆地区老年真菌性角膜炎分离镰刀菌的基因型分布情况〔n(%)〕

表2 外伤史与FSSC和GFSC感染的真菌性角膜炎关系〔n(%)〕

3 讨 论

传统镰刀菌属的菌种鉴定中主要依据菌落形态、颜色，分生形态和方式等形态学特征，但该方法鉴定时间长，镰刀菌生长过程中产生的孢子和菌落易出现变异使结果出现误差〔4，5〕。分子生物学鉴定具有快速、准确的优点，逐渐在临床分离镰刀菌的菌种鉴定中得到应用。相关研究显示，EF1-α、ITS等基因均能够用于镰刀菌的基因和菌种鉴定，但大部分镰刀菌种的ITS存在非直系同源拷贝，影响检测结果的准确性〔6，7〕，因此本次研究采用EF1-α序列对镰刀菌种进行鉴定。镰刀菌根据基因序列分为FSSC、GFSC、FOSC、FCSC等7个复合体，80种镰刀菌，每个复合体包括多种基因型的镰刀菌种。

本次研究结果显示，GFSC在植物相关损伤老年患者中发生率明显高于FSSC，可能原因与GFSC是农作物中的主要病害有关。在无外伤老年患者中FSSC分离率明显高于GFSC，本地区真菌性角膜炎老年患者超过80%生活在农村，老年患者在日常生活中普遍存在尘土、未察觉的危险损伤等感染因素从而引发镰刀菌感染，因此可初步推测FSSC的侵袭力强于GFSC。GFSC在眼部手术老年患者中的发生率也明显高于FSSC，其原因与GFSC易于在接触镜保护液中生长有关，手术过程中使用的接触镜和手术器械中GFSC污染的可能性大于FSSC。

本次研究中对目前临床常用的11种抗真菌药物进行了体外药敏试验，结果显示镰刀菌对那他霉素、两性霉素B、伏立康唑敏感，而对5-FC、制霉菌素、咪康唑、克霉唑敏感性不佳。因此，对于新疆地区新诊出的老年镰刀菌性角膜炎患者应先给予那他霉素、两性霉素B、伏立康唑治疗，等菌种鉴定和药敏试验结果得到后再根据实际情况调整治疗方案。不同基因型镰刀菌的药物敏感性也存在差异，FSSC感染的真菌性角膜炎对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的敏感性明显低于GFSC，但对治疗预后的影响仍需进一步大样本量的长期随访研究。

1 Caroline Z，Marjorie N，Yang FC，etal.Fungal polymerase chain reaction testing in equine ulcerative keratitis〔J〕.Veter Ophthalmol，2013；16(5)：341-51.

2 史伟云，王 婷.我国真菌性角膜炎诊断和治疗中的几个问题〔J〕.中华眼科杂志，2013；49(1)：2-5.

3 Wang N，Zhao GQ，Gao A，etal.Association of TLR2 and TLR4 gene single nucleotide polymorphisms with fungal keratitis in Chinese Han population〔J〕.Curr Eye Res，2014；39(1)：47-52.

4 Pellegrino F，Carrasco MA.Argon laser phototherapy in the treatment of refractory fungal keratitis〔J〕.Cornea，2013；32(1)：95-7.

5 Tananuvat N，Salakthuantee K，Vanittanakom N，etal.Prospective comparison between conventional microbial work-up vs PCR in the diagnosis of fungal keratitis〔J〕.Eye，2012；26(10)：1337-43.

6 王 勇.更昔洛韦眼用凝胶和阿昔洛韦滴眼液治疗单疱病毒性角膜炎疗效观察〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(5)：633-6.

7 陈金鹏，汪 荣，徐辉勇，等.两种手术方式治疗真菌性角膜炎的临床观察〔J〕.中国真菌学杂志，2014；9(1)：36-8，46.

〔2016-10-25修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

新疆兵团英才计划(2013ZX0940-02)；新疆兵团科技攻关项目(2014AB030)

魏 华(1969-)，女，主管护师，主要从事老年眼科研究。

R772.21

A

1005-9202(2017)13-3148-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.011