方氏头针对血管性痴呆大鼠海马组织中炎性因子TNF-α表达的影响

田文静，王瑞辉，黄琳娜，安军明

(1.成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610000；陕西中医学院，陕西 咸阳 712046;3.西安市中医医院针灸推拿科，西安 710001)



【针灸研究】

方氏头针对血管性痴呆大鼠海马组织中炎性因子TNF-α表达的影响

田文静1，王瑞辉2，黄琳娜3，安军明3

(1.成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610000；陕西中医学院，陕西 咸阳 712046;3.西安市中医医院针灸推拿科，西安 710001)

目的： 观察各组大鼠海马组织中炎性因子TNF-α表达的变化，探讨方氏头针治疗VD的作用机理。方法：将40只健康大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和头针组4组各10只，通过改良的4-VO法制备VD模型，随后头针组进行选穴针刺，余3组正常喂养，10 d后采用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力的变化，ELLSA检测大鼠海马区TNF-α表达的变化。结果:与正常组比较，模型组大鼠的平均逃避潜伏期及首次跨越原象限平台的时间均有明显延长，海马组织中TNF-α表达也明显升高，而经头皮针治疗后，大鼠的平均逃避潜伏期及首次跨越原象限平台的时间明显缩短，TNF-α表达明显降低，正常组与假手术组比较差异无统计学意义。结论：方氏头针可以有效改善VD大鼠的学习记忆能力，这可能与方氏头皮针可以调控大鼠海马组织中TNF-α的表达有关。

方氏头皮针；血管性痴呆；炎性因子；TNF-α

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康合格SD大鼠40只，体质量(280±20) g，购于第四军医大学动物实验中心(合格证号scxk-(军)2012-0007)。SPF级鼠房适应性饲养1周后，将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、头针组，每组各10只，保证所有大鼠在实验过程中自由摄食和饮水(术前禁食除外)。

1.2 主要仪器与药品

SDQ-30双极射频电凝器，(上海手术器械厂)，Morris水迷宫(陕西中医学院针灸推拿系基础实验室提供)，大鼠TNF-αELLSA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 VD模型制备

VD模型根据改良后的Pulsinelli，s4-VO法进行制备[6]：手术前大鼠禁食12 h，禁水6 h称重，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 ml/100 g)后，将大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，行背侧枕部正中切口，暴露出第一颈椎两侧横突板上的翼小孔，用直径为0.5 mm的电凝针电凝两侧翼小孔内的椎动脉，致使两侧椎动脉造成永久性闭塞，缝合待大鼠清醒后送回动物房饲养，期间禁食。24 h后再次将大鼠麻醉，仰卧位固定行腹侧颈正中切口，暴露出两侧的颈总动脉，“4”号线挂线，用微动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉各5 min，反复3次，每次间隔1 h，期间用红外灯照射维持大鼠体温在37℃左右，缝合待大鼠清醒后送回动物房内饲养。术后每只大鼠每日给予8万单位青霉素钠皮下注射预防感染。假手术组大鼠除不电凝双侧椎动脉、不夹闭双侧颈总动脉外，余处理皆同模型组，正常组大鼠不做任何处理。

1.4 术后观察

术后1周手术组大鼠的死亡率为15%，均为术后感染而死，另有1只因术后肢体偏瘫不能做划水动作而弃用。

本文基于多源数据，采用假设检验方法实证研究了我国两化融合绩效情况，并探索性地分析了两化融合在加强企业价值创造能力、推动行业综合发展、提升经济发展质量等方面绩效产生的机理，得出以下3点结论：

1.5 治疗

术后10 d，根据方云鹏主编的《头皮针》[7]选穴方法选穴。倒脏上焦：中央沟在头皮表面的投影向后1.5 cm的平行线，即为中央后回在头皮表面的投影(即倒脏穴区，其横向宽度为中央沟与中央后回之间的区域，纵向长度从眉顶枕线向左右两侧旁开1 cm开始计算，平均为9 cm)，倒脏穴区分为上焦、中焦、下焦三部分，其中央后回下部4 cm的区域即为倒脏上焦穴区；记忆穴：以顶枕点、矢状缝与人字缝的交汇点为中心点，分别向左右前下方，与顶枕线呈30°夹角划两条直线，在这两条直线上，与中心点相距7 cm处即为记忆穴；思维穴：左右两额骨隆凸之间，即由眉间棘直上3 cm处； 大鼠比拟人体取穴方法取穴。

穴位常规消毒后，选用0.4 mm×13 mm的无菌华佗牌针灸针，采用“飞刺”的方法将针快速深刺至头骨骨膜(以右手拇指、食指、中指夹持针柄，保持针体平直，利用肘部带动腕部的力量，将针快速垂直刺入，穿透头皮直达颅骨骨膜，留针30 min)，每日针刺1次，连续治疗10 d。

1.6 水迷宫实验

1.6.1 定位航行试验 首先对所有大鼠进行为期2 d的学习训练，训练时将大鼠分别从不同入水点放入水中，以大鼠在2 min内寻找到平台所在位置并爬上平台停留10 s为训练成功。从第3天开始正式实验，每天4次，每次分别从A、B、C、D 4个不同象限的入水点将大鼠放入水中，记录大鼠在2 min内游到平台所在位置并爬上平台的时间，2 min内未爬上平台的大鼠逃避潜伏时间按2 min记录。

1.6.2 空间探索实验 5 d的定位航行实验结束后，第6天撤去平台，分别将大鼠从A、B、C、D 4个不同象限入水点放入水中，记录大鼠在2 min内第1次游过原平台所在位置的时间以及2 min内游过原平台所在位置的次数。

1.7 ELLSA法检测

水迷宫实验结束后将大鼠断头取脑，然后在冰台上迅速剥离两侧的海马组织，将海马组织按2.5 ml/g 脑质量加入相当体积的冰生理盐水，在冰浴中用匀浆器将海马组织充分研磨随后超声波粉碎，进一步将海马组织进行破碎，10000 r/min 4℃ 离心10 min取上清液。随后严格按照TNF-α ELISA 法说明书步骤进行，在酶标仪上读取各孔的OD值，测量波长为450 nm。

2 统计学方法

3 结果

3.1 水迷宫检测结果

表1显示，在为期2 d的定位航行训练中，各组大鼠的逃避潜伏时间均有较大的波动，如正常组大鼠在第1天、第2天的平均逃避时间分别为(44.54±3.18)、(30.54±1.65)。而经过2 d的学习训练后，大鼠的逃避潜伏时间趋于稳定，随后3 d的定位航行试验中，大鼠的逃避潜伏时间分别为(25.86±3.48)、(23.04±3.35)、(22.11±1.84)。因此，为保证数据的稳定性，剔除前2 d的数据，以第3、4、5天的记录数据进行统计分析。结果显示，模型组大鼠在后3 d定位航性试验中的平均逃避潜伏时间比正常组大鼠有明显延长(P<0.01)，提示全脑缺血发生后，大鼠的学习能力出现衰退，说明痴呆模型制备成功。而与模型组大鼠在后3 d的平均逃避潜伏时间比较，头针组大鼠的逃避潜伏时间明显缩短(P<0.01)，提示方氏头皮针的干预可以有效提高VD大鼠的学习能力。正常组与假手术组比较，二者的平均逃避潜伏时间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1显示，在第6天的空间探索实验中，撤去平台后，通过记录大鼠第一次游过原平台所在位置的时间以及2 min内游过原平台所在位置的次数来检测大鼠空间记忆能力的变化。结果显示，模型组大鼠第一次游过原平台所在位置所需时间比正常组大鼠明显延长(P<0.01)，游过原平台所在位置的次数也明显少于正常组(P<0.01)。提示全脑缺血发生后，大鼠的空间记忆能力也出现了明显的衰退。而与模型组大鼠比较，头针组大鼠第一次游过原平台所在位置所需时间有明显缩短，游过次数也明显增多(P<0.01)，提示方氏头皮针干预可以有效改善VD大鼠的空间记忆能力。正常组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2 ELLSA法检测结果

表1显示，各组大鼠海马组织中炎性因子TNF-α表达的检测结果显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠海马组织中TNF-α的表达明显升高(P<0.05)。而头针干预治疗后，大鼠海马组织中TNF-α表达明显降低(P<0.05)。正常组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠Morris水迷宫及ELLSA法检测结果比较

注：与正常组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01

4 讨论

方氏头针是方云鹏老教授在传统经络学说基础上结合现代大脑皮层定位理论所研发的新的针灸疗法。传统经络学说认为[8]，针刺穴位(头穴)后产生的针感反应具有沿循经络的一定路线向躯干、四肢传导的能力，即针刺的循经感传现象。方云鹏根据现代生理学分析认为，针刺的这种循经感传效应并非是体表局部存在此种传导兴奋的机能线，而是神经中枢(可能是大脑皮质)在机能排列在一起特殊的皮层上发生兴奋的结果，并认为经络就是中枢神经系统内特殊机能排列在人体局部的投射，人体上任何一点受到刺激都可以在中枢发生一个兴奋点，在中枢上存在着一些机能上相互关联的细胞，由此而解释了针刺穴位(头穴)能够引起一条感应路线的原因，从而总结性地认为神经是经络的本质，经络是神经功能活动的现象。

方云鹏经过长期临床实践的不断探索和总结，结合现代的大脑皮层功能定位学说，创新性地提出了“大脑功能体表投影理论”，根据大脑皮层的不同功能定位在头皮表面的投影将头部穴位分为伏脏(2区)、伏像(1区)、倒脏(2区)、倒像(2区)等7个中枢刺激区和记忆、思维、说话、运平、信号、听觉、书写、视觉、嗅味、平衡、呼循(除思维是一穴外，其余均为2穴)等22个皮质功能刺激点，由此极大地丰富和发展了头皮针的理论体系。本实验中，笔者根据方云鹏主编《头皮针》的相关论述进行选穴，选择“倒脏上焦”“思维穴”“记忆穴”等。 “倒脏上焦”是顶叶中央后回的下部在头皮表面的投影，“记忆穴”是顶叶的角回在头皮表面的投影，“思维穴”则是额叶前部在体表的投影。研究表明[9-12]，中枢神经系统中空间记忆的产生主要是顶叶和前额叶的协同作用，其中顶叶是空间信息加工的重要脑区，而前额叶则在记忆执行过程中起重要作用。

VD是一类临床病理表型和病理生理机制多样的综合征，其所致的认知受损来源于多种形式的血管性病变，如出血性卒中、缺血性卒中及慢性缺血缺氧等，其中缺血性损伤是导致VD发病最常见的因素。目前VD的发病机理尚未完全阐明，可能的机制包括胆碱能通路受损、Ca2+代谢失调、缺血性损伤后炎症反应导致的迟发性脑损伤等。其中缺血性损伤后的炎症反应一直是VD发病过程中研究的热点。在VD发病过程中，无论是脑卒中还是慢性缺血的过程，都少不了炎症介质的参与。以往的实验研究发现，IL-6、TNF-α、IL-1β、C-反应蛋白等炎症介质与痴呆所致的认知功能缺损紧密相关[13-15]。最新的病理学研究也发现，在VD认知障碍患者的损伤白质中，炎症标志物(如细胞因子和黏附分子)明显增加[16]。笔者通过观察各组大鼠海马组织中炎性介质TNF-α的表达变化也得到了一致的结果，并通过方氏头针的干预验证了其头针能明显改善VD大鼠的认知功能障碍，这与以往我们临床的研究发现一致。以往临床研究发现，方氏头针在改善VD患者认知障碍方面有着非常显著的疗效[17-18]。结合本实验结果，提示在VD的早期治疗中，采用方氏头针控制甚至逆转其认知功能缺损症状是可行的策略，并进一步揭示方氏头针改善VD患者认知障碍的机制可能与调控脑缺血损伤后海马组织中炎性介质TNF-α的表达，从而抑制脑缺血损伤后的炎性反应有关，由此为临床应用和推广方氏头针治疗血管性痴呆提供了可靠的实验依据。

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Effects of Scalp Acupuncture on the Expression of TNF-α in Hippocampal Region of Rats with Vascular Dementia

TIAN Wen-jing1，WANG Rui-hui2，HUANG Lin-na3，AN Jun-ming3

(1.Departmentofacupuncture,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610000,China;2.TraditionalChineseMedicalUniversityofShanxi,Xianyang710012,China;3.DepartmentofacupunctureofXianHospitalofTraditionalChineseMedical,Xian710001,China)

Objectives: This study was intended to observe the effect of scalp acupuncture on the expression of TNF-α in the hippocampal region and explore how to improve vascular dementia with Fang’s scalp acupuncture. Methods: Forty male rats were arbitrarily put into four groups each with 10 rats: normal group, mock group, model group and Fang’s scalp acupuncture group. We used a revised Pulsinelli 4-vessel-occlusion technique to build a vascular dementia model and performed acupuncture on the points of “Si Wei”, “Dao Zang Shang Jiao”, and “Ji Yi”. Acupuncture was applied on those points in the rats for 30 minutes per day. With the Morris water maze, the rats were examined for their capability in learning and memorizing. The enzyme linked immunosorbent assay was used to measure the expression of TNF-α in the hippocampal region. Results: It was found that the expression of TNF-α in the model group was significantly higher than that in the mock and normal groups.It was also seen that the increase in TNF-α was effectively suppressed in the scalp acupuncture group, resulting in the improvement in the memorizing and learning capabilities of the rats. Conclusions: This study indicated that the Fang’s scalp acupuncture was an effective way to treat the vascular dementia of rats by blocking the expression of TNF-α in the hippocampal region, leading to the improvement in their ability in learning and memorizing.

Fang’s scalp acupuncture；Vascular dementia；Inflammatory cytokines； TNF-α

田文静(1984-)，女，医学博士，从事针灸治疗脑源性疾病的临床与实验研究。

R245.32+1

B

1006-3250(2017)06-0833-04

2016-12-16