高效液相色谱法测定番茄粉和番茄调味粉中番茄红素

王延平，梁俪恩

（增城华栋调味品有限公司，广东 广州 511447）

高效液相色谱法测定番茄粉和番茄调味粉中番茄红素

王延平，梁俪恩*

（增城华栋调味品有限公司，广东 广州 511447）

本文建立了一种高效液相色谱测定番茄粉和番茄调味粉中番茄红素含量的方法。色谱柱选用Waters SunFireTMC18（4.60mm×250mm，5.00μm）分离，以90%乙腈水溶液、乙酸乙酯、甲醇为流动相，梯度洗脱，检测波长472nm，流速1.0mL/min，温度30℃，进样量10.00μL。结果发现，番茄红素在0.36～3.68g/mL范围内线性关系良好（R2=0.993），加标回收率为103.33%，RSD为4.00%。本方法可以有效分析番茄粉和番茄调味粉中的番茄红素含量，可应用于含番茄红素的蔬菜及相关保健品中番茄红素含量的测定。

番茄红素；高效液相色谱法；番茄粉；番茄调味粉

番茄红素（Lycopene）最早由Hartsen在1873年从浆果薯蓣（Tamus communisL.berries）中分离出来，为深红色晶体，是一种功能性天然食用色素，分子结构C56H40，属于重要的类胡萝卜素。目前研究发现，其具有抗氧化、清除自由基、促进细胞间的连接和传导、防癌抗癌等多种生理功能。流行病学研究表明，番茄红素可通过膳食摄入降低患癌风险，如前列腺癌、消化道癌和肺癌[1-4]。作为一种功能性天然色素，番茄红素被广泛应用于功能性食品和医药（原料）领域[5]。番茄红素广泛存在于水果和蔬菜当中，成熟的红色植物果实中含量较高，尤其在番茄中的含量最高，可达3～14mg/100g，而且番茄成熟度越高，番茄红素的含量就越多。因此，在番茄及其制品的质量评价中，番茄红素的含量是一个重要指标。番茄粉是以优质成熟番茄制成原浆，经不同的干燥工艺加工而成的天然番茄粉。番茄调味粉是以番茄粉为主要原料，加以其他辅料科学调配，广泛应用于调味制品、功能性食品、糕点、方便食品、膨化食品等领域。

人体无法合成番茄红素，只能通过饮食来摄取，它特有的性质和功能已经引发了世界性的研究开发热潮。番茄红素稳定性很差，容易出现顺反异构体和氧化降解，尤其是高纯度番茄红素由于缺少其他物质的保护，极不稳定，易被氧化破坏。番茄红素具有不溶于水，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂的特点[6]。根据其特性，番茄粉和番茄调味粉中的番茄红素的检测，可以参照的国家标准中番茄红素的测定方法有NY/T957-2006[7]、NY/T1651-2008[8]、GB/T14215-2008[9]、GB/T22249-2008[10]、GB28316-2012[11]、NY/T 3865-2014[12]，其中主要使用的测定方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法等，液相色谱法简便、快速、准确[13]，通过保留时间对番茄红素定性，采用内标法和外标法进行定量，是番茄红素定量检测的可靠方法，其不足在于液相色谱仪器昂贵，尚难普及，且番茄红素标准品非常昂贵，性质不稳定，保管不善容易造成结果偏差；紫外分光光度法以苏丹红I色素为标准品，绘制标准曲线对样品中番茄红素进行定量，此法现为番茄酱检验的标准方法，并被番茄酱生产企业和商品检验部门普遍采用，但该方法耗时，样品不稳定，易见光分解或被氧化，且定量分析较差[14]。前人的研究[15-21]也多围绕番茄、番茄提取物或番茄酱及番茄微胶囊和微胶囊包埋物中番茄红素进行检测，对于番茄粉和番茄调味粉中番茄红素的含量检测的报道并不多见，番茄粉中番茄红素的含量，是决定番茄调味粉口感、风味和品质的关键要素，因此，对番茄粉及由番茄粉调配的番茄调味粉进行番茄红素的检测，对番茄风味调味品系列产品的开发与应用具有重要的意义，特别是番茄调味粉，虽然以番茄粉为主要原料，但是添加了其他辅料，会对检测产生一定的干扰，因此，有效检测番茄调味粉中的番茄红素含量，更具有技术难度与挑战性。本实验在参照上述番茄红素检测的国家标准的基础上，建立了一种适用于番茄粉或含有番茄粉的番茄调味粉中番茄红素含量的检测方法，而且该方法也适用于市面上常见的含番茄红素的番茄调味粉的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄粉A：国产1，采用喷雾干燥工艺生产，番茄风味浓郁；番茄粉B：国产2，采用烘干工艺生产，番茄风味偏弱，价格稍便宜；番茄调味粉：添加番茄粉A含量32%，华栋公司；番茄红素标准品：中国食品药品检定研究院，含量95.90%；β-胡萝卜素标准品：中国食品药品检定研究院，含量＞90%；二氯甲烷、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、焦性没食子酸均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇，均为色谱纯，Merck公司生产。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪，Waters e2695-2489，沃特世公司；分析天平，BSA224S-CW型，赛多利斯公司；

721可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；旋涡混合器，VORTEX-6，海门其林贝尔；

超声波清洗器，KQ-100B型，昆山市超声仪器有限公司；

电热恒温水浴锅，HWS12型，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试液的配制

1.3.10 .5 %BHT二氯甲烷溶液的配制

称取2.5gBHT至500.0mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容，得0.5%BHT二氯甲烷溶液。

1.3.2 焦性没食子酸二氯甲烷溶液的配制

称取5.0g焦性没食子酸至100.0mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容，取上清液备用。

1.4 供试品溶液的制备

现配现用。分别称取番茄粉样品A和番茄粉样品B及番茄调味粉样品0.05g各两份于50.0mL具塞三角瓶中，加入10.0mL蒸馏水，涡旋震荡2min，一份加入5.0mL 0.5%BHT二氯甲烷溶液及10.0mL二氯甲烷溶液，一份加入5.0mL焦性没食子酸二氯甲烷溶液及10.0mL二氯甲烷溶液，再涡旋2min，超声提取10min，静置待分层，用一次性注射器吸取下清液（二氯甲烷有机层）于100.0mL棕色容量瓶中，继续加入10.0mL二氯甲烷溶液，涡旋2min，超声提取10min，静置待分层，用一次性注射器吸取下清液（二氯甲烷有机层），合并有机相样品收集液，重复3次，至水相颜色变为微黄色，将样品收集液用二氯甲烷定容至100.0mL，震荡摇匀，待用。

1.5 标准品溶液的制备（临用新配制）

1.5.1 番茄红素标准储备液的制备（0.5%BHT二氯甲烷溶液作溶剂）

精密称取番茄红素标准品4.6mg，置于25.0mL棕色容量瓶中，加入10.0mL0.5%BHT二氯甲烷溶液，超声至完全溶解，定容，混合均匀，制成浓度为184.0g/mL的番茄红素标准储备液，备用。

1.5.2 番茄红素标准储备液的制备（焦性没食子酸二氯甲烷溶液作溶剂）

精密称取番茄红素标准品4.2mg，置于25.0mL棕色容量瓶中，加入10.0mL焦性没食子酸二氯甲烷溶液，超声至完全溶解，定容，混合均匀，制成浓度为168.0g/mL的番茄红素标准储备液，备用。

1.5.3 番茄红素标准溶液的标定

分别吸取0.5mL（V1）1.5.1和1.5.2的番茄红素标准储备液至25.0mL（V2）棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀，采用紫外/可见分光光度，1.0cm比色皿，波长472nm，测量番茄红素标准溶液吸光度值，以二氯甲烷作空白。按照式（1）计算番茄红素标准溶液中番茄红素的浓度CST（g/mL）。

式中：AMAX，番茄红素标准品在472nm处的吸光度值；10000，浓度换算因子；D，V2/V1，稀释因子；3450，番茄红素的吸光系数。

1.5.4 番茄红素标准工作溶液的制备

分别吸取1.5.1和1.5.2的番茄红素标准储备液0.02mL、0.025mL、0.05mL、0.075mL、0.1mL、0.2mL于容量瓶中，加入二氯甲烷溶液适量，涡旋震荡片刻，加入二氯甲烷至刻度，摇匀，分别得到浓度为0.36g/mL、0.46g/mL、0.92g/mL、1.38g/mL、1.84g/mL、3.68g/mL的番茄红素0.5% BHT二氯甲烷溶液和浓度为0.33g/mL、0.42g/mL、 0.84g/mL、1.26g/mL、1.68g/mL、3.36g/mL的番茄红素焦性没食子酸二氯甲烷溶液。

1.6 色谱条件

采用Waters SunFireTMC18（4.60mm×250mm，5.00μm）色谱柱，紫外/可见检测器（UV/Visible Detector）。流动相A，90%乙腈水溶液；流动相B，乙酸乙酯；流动相C，甲醇；采用梯度洗脱程序，见表1。流速，1.0mL/min；检测波长，472nm；柱温，30℃；进样量，10.0μL。

表1 番茄红素检测流动相梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 样品前处理的讨论

番茄红素是脂溶性色素，检测时对样品前处理的要求很高。番茄红素不溶于水，溶于二氯甲烷，将番茄粉和番茄调味粉用水溶解，然后加入二氯甲烷，通过溶剂的萃取，将番茄红素成分分散于二氯甲烷有机相中，通过多次重复萃取，可以使番茄粉或番茄调味粉中的番茄红素基本被萃取出来。经过反复摸索，本实验的前处理方法总结如下：称取番茄粉样品约0.05g于50.0mL具塞三角瓶中，加入10.0mL蒸馏水，涡旋震荡2min，加入5.0mL 0.5%BHT二氯甲烷溶液及10.0mL二氯甲烷溶液，再涡旋2min，超声提取10min，静置待分层，用一次性注射器吸取下清液（二氯甲烷有机层）于100.0mL棕色容量瓶中，继续加入10.0mL二氯甲烷溶液，涡旋2min，超声提取10min，静置待分层，用一次性注射器吸取下清液（二氯甲烷有机层），合并有机相样品收集液，重复3次，至水相颜色变为微黄色，将样品收集液定容至100.0mL，震荡摇匀，待用。

2.2 系统适应性试验

精密称取番茄红素标准品和β-胡萝卜素标准品适量两份，置于25.0mL棕色容量瓶中，分别加入5.00mL0.5%BHT二氯甲烷溶液和焦性没食子酸二氯甲烷溶液，涡旋溶解，用二氯甲烷定容至刻度，用二氯甲烷稀释至1.0g/mL，进行液相上机测试。番茄红素和β-胡萝卜素的分离度应不小于1.0[21]。

由图1可知，色谱图中相邻两主成分色谱峰分离度良好，见图1，色谱峰1和色谱峰2分离度良好，其中理论塔板数按番茄红素色谱峰计算大于3000，拖尾因子T=0.98，番茄红素的保留时间为16.31min，β-胡萝卜素的保留时间为17.79min，计算得分离度为1.64，两峰完全分离，系统适应性符合规定。

图1 系统适用性试验色谱图

2.3 抗氧化剂的选择性试验

因为番茄红素还原性强，容易被氧化，相关国标中分别有要求在溶解番茄红素的溶液中加入BHT或焦性没食子酸作为抗氧化剂，本实验分别用BHT和焦性没食子酸作为抗氧化剂作了整个系列的实验，实验结果表明，用BHT和焦性没食子酸作为抗氧化剂得到的番茄红素图谱（见图2）差别不大，但是从化学性质方面考虑，BHT可以添加到食品中，在一定范围内食用安全，而且容易获得，溶解性良好，可以快速溶解于二氯甲烷之中，焦性没食子酸有很高毒性，可以使皮肤中黑色素沉积，价格是BHT的三倍，其在二氯甲烷中微溶，在本实验中使用的是焦性没食子酸二氯甲烷的饱和溶液不易得到，因此基于实验室安全和实际操作的上述原因，本实验选择BHT作为抗氧化剂比较合适。

图2 不同溶剂配制的番茄粉中番茄红素的HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围

将1.5.1和1.5.2配制的番茄红素标准工作溶液，在选定的色谱条件下进行测定，结果表明番茄红素在0.36～3.68g/mL和0.33～3.36g/mL质量浓度范围呈良好的线性关系，线性方程分别为y=0.0000057x+0.014和y=0. 0000054x+0.011，相关系数R2均为0.998和0.998。

2.4.2 检测限和定量限

一般情况，以3倍信噪比作为仪器检测限，10倍信噪比作为仪器定量限，按照本实验的仪器色谱条件，采用不含番茄红素的空白样品进行比对，计算得到本方法的检测限为0.0028g/mL，定量限为0.013g/mL。

2.4.3 重复性

按照1.4样品溶液的制备方法，制备同一种番茄红素样品6份，按照1.6的色谱条件进行测定，得到检测样品的RSD＜2.0%，实验说明该方法的重复性良好。

2.4.4 精密度

取番茄红素质量浓度为1.38g/mL的标准溶液10.0μL进样，连续进样6次，计算得RSD为1.46%，结果见表2，数据说明仪器精密度良好。

表2 精密度实验结果

表3 常温保存稳定性实验结果

表4 冷冻存放稳定性实验结果

表5 加标回收率实验结果

表6 番茄粉和番茄调味粉样品中番茄红素含量测定结果

2.4.5 稳定性

番茄红素具有较强的还原性，容易被氧化，本实验经过对在常温放置的制备样品和在冰箱冷冻室（-18℃）存放的样品进行稳定性实验，取番茄红素质量浓度为1.38g/mL的标准溶液10.0μL进样，常温在0～8h（即1d的工作时间内）每隔1h依法进样测定峰面积，计算RSD值，冷冻存放在0～7d每隔1d依上法进样测定峰面积，计算RSD值。结果表明，番茄红素在室温（25℃以内)条件下，8h可以使RSD保持在5.0%以内，冷冻保存在7d试验期之内，RSD＜2.0%，结果见表3、4。

2.4.6 加标回收率

精密称取番茄红素标准品3.48mg，置于5.0mL棕色容量瓶中，加入2.0mL 0.5%BHT二氯甲烷溶液，超声至完全溶解，定容，混合均匀，得到番茄红素标准溶液。准确称取13.6g番茄粉A，加入该番茄红素标准溶液，震荡拌匀。按照1.6方法进行番茄红素含量的检测，并计算加标回收率，实验结果见表5。由表可知，该方法条件下，加标样品的平均回收率为103.33%，RSD为4.00%。上述结果表明本实验的HPLC分析方法结果准确可靠。

2.5 样品的检测

图3 番茄红素标准样品和样品的HPLC色谱图

番茄红素标准样品和样品的HPLC色谱图见图3。番茄粉和番茄调味粉中番茄红素含量的测定结果见表6，其中番茄粉A中的番茄红素含量为135.49mg/100g，符合标准NY/T957-2006[12]的要求（番茄粉中番茄红素的含量100.00mg/100g），番茄粉B中的番茄红素含量为91.88mg/100g，低于上述标准的要求。由表6可见，添加32%样品A番茄粉配制的番茄调味粉中番茄红素的含量为40.66mg/100g。以番茄粉A中番茄红素的含量为135.49mg/100g，番茄粉A在番茄调味粉中的添加量为32.0%。

3 结论

本实验建立了一种用HPLC测定番茄粉和番茄调味粉中番茄红素的方法，因为番茄红素还原性强，容易被氧化，相关国标中分别有要求在溶解番茄红素的溶液中加入BHT和焦性没食子酸作为抗氧化剂，本实验分别用BHT和焦性没食子酸作为抗氧化剂作了整个系列的实验，实验结果表明，用BHT和焦性没食子酸作为抗氧化剂得到的番茄红素标准曲线和实验结果差别不大，但是基于实验室安全和实际操作的理由，我们建议选择BHT作为本实验的抗氧化剂。

国家标准中番茄红素测定选用的流动相由甲醇和乙腈组成（50:50），本研究在此基础上添加了乙酸乙酯，乙腈采用90%水溶液，并设定了梯度洗脱方法，该方法非常稳定，实验精密度RSD＜2.0%，在该色谱条件下，番茄红素和β-胡萝卜素可以分离（分离度＞1.0），可以有效避免β-胡萝卜素的干扰。

该方法能够有效分析番茄粉和番茄调味粉中的番茄红素含量，可以作为番茄粉和番茄调味粉的一项质量检测标准对其进行质量控制和把关，可以有效保证企业的良好信誉和客户的利益。本方法也可以用于含番茄红素的蔬菜及相关保健品中番茄红素的测定。

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Determination of Lycopene in Tomato Powder and Tomato Seasoning Powder by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yan-ping,LIANG Li-en*
(Zengcheng Handyware Seasoning Co.,Ltd.,Guangzhou 511447,China)

In this paper,the author developed the determination method of lycopene in tomato powder and tomato seasoning powder by high performance liquid chromatography(HPLC).Chromatographic separation was performed in Waters SunFireTMC18 column(4.60mm×250mm,0.5μm)with an eluent consisting by 90%acetonitrile,acetic ether and methanol, using gradient elution program.Detection wavelength was at 472nm,the flow rate was 1.0mL/min,and the column temperature was at 30℃,the sample volume was 10.00μL.Experimental results showed that lycopene had a good linear relation over the range of 0.36～3.68μg/mL(R2=0.993),and the average recovery was 103.33%,RSD was 4.00%.This effective analysis method of lycopene content in tomatoes and tomato powder seasoning powder developed in this paper,it could be used for the determination of lycopene in vegetables containing lycopene and related lycopene healthcare products.

Lycopene;HPLC;tomato powder;tomato seasoning powder

S641.2

A

1008-1038(2017)06-0010-06

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.06.003

2017-03-27

王延平（1963—），男，高级工程师，研究方向为食品工业与工程

*通讯作者：梁俪恩（1972—），女，高级工程师，研究方向为化工分析