SELDI-TOF-MS技术筛选鼻型NK/T细胞淋巴瘤血清分子标志物的研究

陈道光，黄传钟，叶韵斌，杨 瑜，陈 刚，吴君心，吴 晖，何鸿鸣，王立峰，肖景榕，杨秀玉

(福建医科大学教学医院、福建省肿瘤医院，福建 福州 350014)

SELDI-TOF-MS技术筛选鼻型NK/T细胞淋巴瘤血清分子标志物的研究

陈道光，黄传钟，叶韵斌，杨 瑜，陈 刚，吴君心，吴 晖，何鸿鸣，王立峰，肖景榕，杨秀玉

(福建医科大学教学医院、福建省肿瘤医院，福建 福州 350014)

目的 本文将SELDI-TOF-MS技术应用于鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者与健康人的血清蛋白质图谱的建立，寻找血清差异表达蛋白并建立诊断初步模型，分析可能的肿瘤诊断标志物。方法 采用SELDI质谱技术，将血清蛋白质结合于弱阳离子芯片上，建立30例鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者以及58例健康对照人群的血清蛋白质图谱，应用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析2组图谱之间的差异，通过差异峰建立分类树诊断模型，随机选取21例NK/T细胞淋巴瘤和25例健康对照进行盲筛。结果 在鼻型NK/T细胞淋巴瘤和健康对照人群的血清蛋白质峰中有41个峰表达差异有统计学意义(P<0.05)，经Biomarker Pattern软件和分类回归树的统计原理筛选出最佳的组合模型，联合其中的2个质荷比为5 641、27 427的差异蛋白峰建立淋巴瘤诊断模型，此分类树模型可正确划分93.10%(27/29)的淋巴瘤患者和96.30%(52/54)的健康人。盲筛验证的敏感性为95.24%(20/21)，特异性为100.00%(25/25)。结论 SELDI-TOF-MS技术可用于鉴别鼻型NK/T细胞淋巴瘤，其建立的分类树模型有望成为诊断鼻型NK/T细胞淋巴瘤的辅助指标。

鼻型NK/T细胞淋巴瘤；肿瘤标志物；蛋白质组学；表面加强激光解析电离化飞行时间质谱

鼻型NK/T细胞淋巴瘤是NK/T细胞淋巴瘤的一种特殊亚型，发病地域性明显，主要在亚洲及部分南美地区[1]，北美及欧洲国家少见，临床上多表现为鼻腔、韦氏环受累，常伴发热，发病与EB病毒具有明显的相关性，虽然病例数少，但其侵袭性高，化疗不敏感，即使早期病例，放疗后将近50%的病例终将复发，晚期及复发病例预后差，生存期短，目前临床上评价疗效、判定疾病的复发仍然依赖影像学检查。但是，影像学通常是滞后的且价格昂贵，尤其是评价淋巴瘤疗效金标准的PET-CT。另一方面，鼻型NK/T细胞淋巴瘤除了分期以外，其他的预后因素尚不明确，多项临床研究显示淋巴瘤国际预后指数(IPI)在该型中无预后意义[2-3]，因此，迫切需要能反映预后的新指标、新技术。

表面加强激光解析电离化飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)是蛋白质组学研究中一种全新的技术平台,具有高通量、快速、敏感等特点，可以在少量的生物粗样本中同时发现多个低丰度的生物标志物[4]，将其用于肿瘤诊断,具有较高的敏感性和特异性，在肿瘤筛查、分级、早期诊断等方面具有良好的应用前景。

目前国内应用SELDI-TOF-MS研究淋巴瘤主要集中在弥漫大B细胞淋巴瘤[5]，本研究针对鼻型NK/T细胞淋巴瘤这一特殊类型，病理上以血管中心性病变、血管破坏和坏死为主，通过分析30例鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者与58例健康人的血清蛋白质谱，筛选出相关的差异蛋白峰，为鼻型NK/T细胞淋巴瘤提供早诊和预后指标奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 病例选择 入组2012年1月至2014年12月福建省肿瘤医院收治的经病理检查确诊的鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者30例，年龄25～66岁，中位年龄47岁；男21例，女9例。并采集所有患者治疗前血清标本。收集同期福建省肿瘤医院体检中心健康人58例作为对照，男36例，女24例，中位年龄44岁。并采集健康人血清标本。所有患者与健康人均抽取清晨空腹时前臂静脉全血5 mL于无添加剂采血管中，全血静置后于4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min,取血清,分装后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 主要试剂 芥子酸、弱阳离子交换芯片(CM10)、PBS缓冲液、质谱仪均购自美国Ciphergen公司。乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、尿素和CHAPS缓冲液均购自美国Sigma公司。

1.3 芯片及样品处理 从-80 ℃冰箱中取出血清样品，以4 ℃、10 000 r·min-1离心5 min，取10 μL血清，加20 μL U9处理液，充分混匀，冰浴振荡30 min(400～ 600 r·min-1)，取出9 μL加360 μL CM 10缓冲液立即混匀，避免产生蛋白质沉淀。将已加样处理的CM10芯片装入生物孵育器中，每孔加入200 μL缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5 min，甩干。每孔分别加人100 μL样品混合液，振荡孵育1 h，用200 μL洗脱缓冲液室温振荡洗涤2次；拆开生物孵育器，取出芯片，晾干后，每点加2次1 μL SPA，晾干后上机检测。

1.4 数据采集与分析 将芯片置入Protein Chip Biomarker System Ⅱ质谱仪处理,检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下：激光强度215,检测敏感度10，优化相对分子质量范围2 000～50 000。用Ciphergen ProteinChip软件读取蛋白质芯片上的数据，形成血清蛋白质质谱图，其纵坐标(峰值)为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析蛋白质质谱图数据和蛋白质峰强度与数量的差异性,控制筛选出的蛋白质峰在10%以上的不同样本中同时存在，且同一蛋白质峰在不同样本中的偏差<0.3%。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计学分析，对不同组中相同质荷比的蛋白质含量数据进行单因素方差分析，对治疗前后质谱变化分析采用自身配对t检验，应用Ciphergen ProteinChip软件读取蛋白质芯片数据，应用BioMarker Wizard软件对得到的数据进行差异性分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 鼻型NK/T细胞淋巴瘤组与健康人组血清蛋白质差异表达模型的建立 将30例初治鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者与58例健康人血清用PBSⅡ质谱仪(CM10芯片)进行检测。经数据采集、Biomarker Wizard软件比较分析后，共有41个血清蛋白质峰在鼻型NK/T细胞淋巴瘤和健康人中表达差异有统计学意义(P<0.05)，淋巴瘤患者血清中蛋白峰表达上调的有15个，下调的有26个。结合2组均数差距及标准差的大小，从中筛选出8个差异有统计学意义的蛋白峰，其中，淋巴瘤组升高的蛋白质峰(质荷比)为2 727、5 641、6 644，降低的蛋白质峰为2 753、3 412、4 098、8 725、8 792。应用Biomarker Pattern软件对SELDI-TOF-MS质谱获得的峰值数据进行分析处理，采用Gini决策分类树分析法(敏感性0.05)，并选择有显著差异的蛋白质峰建立分类树模型。BPS法判别分析择优选出质荷比为5 641、2 727的2个蛋白质峰，建立鼻型NK/T细胞淋巴瘤与健康人的差异蛋白峰分类树模型。将81例血清蛋白质图谱分成2组，以5 641蛋白差异峰为节点1，其中峰值≤1.435的32例样本划分到节点2中，峰值>1.435的49例样本划分到终节点3中，诊断为健康人。将节点2中的32例样本继续以2 727蛋白差异峰为节点进行划分，其中峰值≤2.63的5例样本划入终节点1中，同样诊断为健康人，峰值>2.63的27例样本划入终节点2中，诊断为鼻型NK/T细胞淋巴瘤。从中我们可以看到，该分类树模型将29例鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者中的27例划分为患者，2例划分错误，而健康人全部划分正确，因此该模型可正确划分93.10%(27/29)的鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者和96.30%(52/54)的健康人。

2.2 NK/T细胞淋巴瘤血清差异蛋白分类树模型的盲筛试验及诊断价值 为了进一步验证所建立模型的正确性、可应用性，另外随机选取46份血清，其中经病理确诊为NK/T细胞淋巴瘤的标本21例，正常健康人标本25例。将血清通过CM10芯片富集、SELDI蛋白质谱检测后，得到的质谱数据进入该分类树模型进行盲筛，该模型最终判定46例血清标本中有20例来源于NK/T细胞淋巴瘤患者，26例为健康人，其中1例患者被误判为健康人，而25例健康人全部判断正确，没有误判为淋巴瘤患者。由此可见，该分类树模型的盲筛验证的敏感性为95.24%(20/21)，特异性为 100.00%(25/25),阳性预测值为100.00%(20/20)，阴性预测值为96.15%(25/26)。见表1。

表1 NK/T细胞淋巴瘤患者血清差异蛋白分类树模型盲筛结果 n

3 讨论

鼻型NK/T细胞淋巴瘤是一种来源于NK/T细胞，以面部中线部位的组织破坏为特征，WHO在对淋巴组织肿瘤进行分类时，将其划为非霍奇金淋巴瘤的一个独立病种[6]。由于鼻型NK/T细胞淋巴瘤发病率低，发病人群少，相关研究不受重视且滞后，给该病的治疗造成了影响，如何提高鼻型NK/T细胞淋巴瘤的诊断率是目前迫切需要解决的问题[7]。夏忠军等[8]指出在入组的75例淋巴瘤首诊患者血清中，β2微球蛋白的含量高于正常值的约占52%，而其中52例弥漫大B细胞淋巴瘤患者中，β2微球蛋白升高的占77%，乳酸脱氢酶升高的占25%，β2微球蛋白在其他肾脏疾病及血液病中同样升高明显，而乳酸脱氢酶受心脏疾病、肝脏功能等影响也较大，因此，将这2项指标作为诊断指标，其敏感性和特异性均不理想。

本研究将30例初治的鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者与58例健康人血清蛋白经过SELDI质谱检测，建立血清蛋白图谱，经软件比较分析后，共发现41个血清蛋白质峰在NK/T细胞淋巴瘤患者中的表达与健康人又差异，其中蛋白峰表达升高的有15个，下降的有26个。通过进一步软件筛选，发现在淋巴瘤患者血清中升高的蛋白质峰(质荷比)2 727、5 641、6 644，降低的蛋白质峰2 753、3 412、4 098、8 725、8 792，这8个蛋白峰与健康人比较有非常显著的统计学差异。同时通过BPS软件以2 727、5 641的2个蛋白峰为节点建立淋巴瘤与健康对照组差异蛋白峰分类树模型，可正确划分93.10%(27/29)的淋巴瘤患者和96.30%(52/54)的健康人，该分类树模型的盲法验证的敏感性为95.24%(20/21)，特异性为100.00%(25/25),阳性预测值为100.00%(20/20)，阴性预测值为96.15%(25/26)。Zhang等[9]应用SELDI-TOF-MS技术共分析了132例弥漫大B细胞淋巴瘤和75例正常对照，获得7个蛋白差异峰，其建立的分类树模型用于鉴别弥漫大B细胞淋巴瘤，敏感性和特异性均可以达到94%。通过比较发现，本研究所获得淋巴瘤差异峰与Zhang等[9]不同，主要是由于本研究所使用的是弱阳离子交换芯片(CM10)，而Zhang等[9]使用的是WCX2芯片，不同芯片结合的血清蛋白也不同，这是造成不同论文得到的蛋白差异峰不尽相同的主要原因。其次，本研究针对较为罕见的鼻型NK/T细胞淋巴瘤，与其他论文的研究对象不同，也是导致差异的原因所在。

综上所述，SELDI-TOF-MS技术在鼻型NK/T细胞淋巴瘤的辅助诊断方面具有一定的参考价值。虽然目前临床上有将部分血清标志物应用于淋巴瘤的辅助检查，但是缺乏足够的敏感性和特异性，临床应用价值很低，本研究提供的鼻型NK/T细胞淋巴瘤模型为其辅助诊断提供了新的方向，值得进一步研究。同时，我们也看到了SELDI-TOF-MS技术的局限性，无法准确得知所获取蛋白峰代表的具体蛋白质名称。因此，经SELDI技术筛选出的异常蛋白峰，经过进一步以免疫印迹、免疫组化等方法进行检验鉴定，更进一步通过分子生物学阐明其致病机制，必将能为临床淋巴瘤的诊治提供更多参考依据。

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[8] 夏忠军，黄仁魏，吴祥元，等. 非霍奇金氏淋巴瘤患者血清β2-微球蛋白检测对预后的价值[J].癌症，2001，20(4):406-408.

[9] ZHANG X,WANG B,ZHANG XS,et al.Serum diagnosis of diffuse large B-cell lymphomas and further identification of response to therapy using SELDI-TOF-MS and tree analysis patterning[J].BMC Cancer，2007,7:235.

福建省医学创新项目(编号：2012-CX-8)

陈道光(1970-)，男，硕士，副主任医师，主要从事恶性淋巴瘤研究。E-mail:cdg70@126.com

杨瑜(1962-)，男，主任医师，主要从事恶性淋巴瘤诊治研究。E-mail: yangyu901@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.03.024

R733.1;R730.4

B

1673-5412(2017)03-0250-03

2016-06-03)