低频经颅磁刺激对VCI大鼠学习记忆及海马突触可塑性的影响

王宏伟 刘宝俊 毛细江 王昌权 涂强 黄毅 路承彪

(1.长江大学医学院 湖北 荆州 434023； 2.黄河三门峡医院 儿科 河南 三门峡 472000；3.长江大学第一附属医院 NCU 湖北 荆州 434000)

低频经颅磁刺激对VCI大鼠学习记忆及海马突触可塑性的影响

王宏伟1刘宝俊2毛细江1王昌权1涂强3黄毅3路承彪1

(1.长江大学医学院 湖北 荆州 434023； 2.黄河三门峡医院 儿科 河南 三门峡 472000；3.长江大学第一附属医院 NCU 湖北 荆州 434000)

目的 研究低频经颅磁刺激(rTMS)对血管性认知障碍(VCI)大鼠学习记忆的影响机制。方法 健康雄性SD大鼠60只，随机分为正常对照组(normal)、假手术组(sham-operated)、模型组(VCI)、rTMS刺激组(VCI +rTMS)。Morris水迷宫进行行为学认知实验，电生理学测定大鼠脑片海马齿状回(DG)在高频刺激下(HFS)诱发的突触长时程增强(LTP)现象。结果 水迷宫实验中，第4天起rTMS刺激组大鼠逃避潜伏期与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；电生理实验中，10 min时rTMS刺激组PS幅值升高，LTP幅值变化率与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 rTMS增加VCI大鼠海马区LTP效应从而增强突触的功能可塑性，改善VCI大鼠的认知功能。【关键词】 低频经颅磁刺激；血管性认知障碍；海马；学习记忆；长时程增强

随着老龄化的到来，我国卒中发病率日益增加。卒中患者中高达64%伴有不同程度的认知功能障碍，进展为血管性痴呆的可能性也成倍增加[1]。血管性痴呆(vascular dementia, VD)对老年人的健康和生活质量造成极大威胁，给社会家庭带来沉重的负担[2]。VD临床表现为认知和记忆功能障碍。记忆认知与中枢神经突触的可塑性变化密切相关。中枢突触LTP是神经突触功能可塑性的一个重要表现形式，反应了突触水平的记忆过程，是脑科学研究中衡量突触功能可塑性的主要指标[3]。海马作为研究学习记忆功能的关键部位是具有可塑性的一个重要脑区。Morris水迷宫检测的大鼠学习记忆能力是一种空间参考记忆，属于陈述性记忆，痴呆患者正是表现为陈述性记忆受损明显。低频经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)是近年逐渐应用于临床的一种影响和改变大脑功能的生物刺激技术，作为一种新型治疗手段已在多种神经精神疾病的治疗中得到了肯定。

实验拟以模型组血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)大鼠为研究对象，从行为学和电生理实验两方面探讨低频rTMS对VCI大鼠学习认知能力和对大鼠海马齿状回(dentate gyrus，DG)区突触长时程增强(long-term potentiation，LTP)为指标的突触可塑性的影响，希望为血管性认知障碍患者的治疗提供新的实验依据和治疗手段。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 经颅磁刺激治疗仪、Morris水迷宫系统、人工脑脊液(配置)、LEICA VT1200S 振动切片机、DS3电子刺激器、SS-202J刺激隔离器、NL104信号放大器、Micro140生物信号处理器、Spike2数据分析软件。

1.2 动物及分组 2个月龄大雄性SD大鼠60只，随机等分为正常组、假手术组、模型组、rTMS刺激组。实验大鼠购自湖北省疾控中心实验动物中心。

1.3 模型大鼠制备 采用反复夹闭及再通双侧颈总动脉伴低血压法模拟反复脑缺血，制备大鼠血管性痴呆模型。参照王蕊等[4]方法制作VCI动物模型。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水，1%戊巴比妥纳腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，常规消毒，颈部正中切口分离双侧颈总动脉(common carotid arteries，CCA)，模型组在夹闭双侧CCA前，腹腔内注射硝普钠(2.5 mg/kg，用双蒸馏水溶解)，随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA 10 min，再通10 min，再夹闭10 min，缝合伤口放回笼中保温继续饲养。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不夹闭双侧CCA及腹腔注射硝普钠。伤口撒磺胺粉预防感染，手术结束后饲养7 d。

1.4 低频经颅磁刺激方法 造模成功后，治疗采用低频1 Hz，10个脉冲/串，每串间隔2～3 s，20串/d，强度为0.5 T，1个疗程为5 d，共4个疗程，每个疗程间隔2 d。实验过程中rTMS刺激组大鼠均有很好耐受性，未见异常现象发生。

1.5 Morris水迷宫实验 大鼠适应环境后开始，实验持续5 d，大鼠向池壁不同象限入水，记录在120 s内大鼠寻找到平台所用的时间(即逃避潜伏期)。结果以大鼠寻找到站台的时间表示。120 s内未能找到平台，潜伏期记为120 s。

1.6 电生理学实验

1.6.1 大鼠脑片制备 断头取脑，振动切片机切制成含海马层面的活体脑片，置于灌流有95%O2+5%CO2混合气体与人工脑脊液的灌流槽内。刺激电极置于大鼠内嗅区前穿通纤维区，记录电极置于海马齿状回。调整刺激电极和记录电极的位置，找到固定强度的刺激记录到最大的群峰电位(population spike、PS)时将两电极固定。刺激由DS3电子刺激器产生，经刺激隔离器和刺激电极输向前穿通纤维区，诱发的动作电位经生物放大器在记忆示波器上显示，输入计算机经Spike2数据分析软件进行分析作为齿状回颗粒细胞群兴奋性的指标[5]。

2 结果

2.1 低频rTMS对各组大鼠水迷宫实验中逃避潜伏期的影响 实验中VCI模型组大鼠逃避潜伏期一直处在较高的水平。 第1、2天，各组在大鼠逃避潜伏期比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第3天开始，各组大鼠逃避潜伏期有显著缩短，正常组大鼠逃避潜伏期与假手术组和模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。第4天时，rTMS刺激组逃避潜伏期与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期比较±s，s)

注：模型组与假手术组、正常组比较，aP<0.01；模型组与rTMS组比较，bP<0.05。2.2 低频rTMS对各组大鼠海马DG区HFS诱导的LTP的影响 各组在给予HFS后PS幅值变化率均出现增加，记录时间内未见明显减弱。各时间节点上VCI模型组PS幅值变化率与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。10 min时，rTMS刺激组PS幅值变化率开始较大幅度增加，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组与正常组PS幅值变化率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明手术操作对大鼠海马LTP无影响。见图1、2。

注：正常组与模型组比较，cP<0.05；rTMS刺激组与模型组比较，dP<0.01。

图2 HFS刺激前后变化图(MN为PS变化幅度，A：HFS前，B：HFS后)

3 讨论

血管性痴呆和阿尔茨海默病是引起痴呆的两大主要原因。痴呆已成为一个越来越严峻的社会、经济、家庭以及公共卫生问题。关于学习、记忆等认知缺陷的修复是当今世界上脑科学研究的一个热点。但与阿尔茨海默病变性为主的病理改变不同的是血管性痴呆病因多、病理机制复杂，临床治疗中束手无策，无特效的药物和治疗办法。

rTMS通过线圈内电流的瞬变从而形成高强度的交变磁场，可在深部脑区产生感应电流而起作用[6]。作为非药物干预技术已应用于一些神经和精神系统疾病的治疗并取得了不错的效果[7]。实验中经低频rTMS刺激的大鼠都表现出很好的耐受性。但目前在血管性认知障碍机制方面有关rTMS的研究报道较少。

实验在动物行为学和电生理学方面为rTMS的临床应用提供了理论依据。VCI模型大鼠表现为学习记忆能力下降。在低频rTMS刺激后VCI大鼠学习记忆能力改善。神经细胞之间的突触可塑性变化则是学习记忆的神经生物学基础。海马齿状回LTP明显增加，表明低频rTMS刺激可使VCI大鼠海马DG区的神经突触间功能可塑性增强。这可能是rTMS改善VCI大鼠认知学习功能的分子突触机制。rTMS丰富了当前VCI的治疗手段，众多的血管认知障碍患者或许会从中受益，在突触结构可塑性方面仍要进一步探索研究完善。

[1] Seshadri S,Beiser A,Kelly-Hayes M,et al.The lifetime risk of stroke:estimates from the Framingham Study[J].Stroke,2006,37(2):345-350.

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[3] Morris R G.Elements of a neurobiological theory of hippocampal function:the role of synaptic plasticity,synaptic tagging and schemas[J].Eur J Neurosci,2006,23(11):2829-2846.

[4] 王蕊,杨秦飞,唐一鹏,等.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进[J].中国病理生理杂志,2000,16 (10):914-916.

[5] Gruart A,Munoz M D,Delgado-Garcia J M.Involvement of the CA3-CA1 synapsein the acquisition of associative learning in behave mice[J].Neuroscience,2006,26(4):1077-1087.

[6] 户东梅,程肖蕊,周文霞,等.重复经颅磁刺激对脑卒中后认知功能障碍治疗的研究进展[J].生理科学进展,2012,43(6):411-416.

[7] Zhang B,Chen X,LinY,et al.Impairment of synaptic plasticity in hippocampus is exacerbated by methylprednisolone in a rat model of traumatic brain injury[J].Brain Res,2011,1382:165-172.

Effects of low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation on learning and memory and synaptic plasticity in hippocampus of vascular cognitive impairment rats

Wang Hongwei1, Liu Baojun2, Mao Xijiang1, Wang Changquan1, Tu Qiang3, Huang Yi3, Lu Chengbiao1

(1.MedicalCollegeofYangtzeUniversity,Jingzhou434023,China; 2.DepartmentofPediatrics,HuangheSanmenxiaHospital,Sanmenxia472000,China; 3.DepartmentofNCU,theFirstAfflicatedHospitalofYangtzeUniversity,Jingzhou434000,China)

Objective To study the effect of low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) on learning and memory and the long-term potentiation (LTP) in hippocampus of vascular cognitive impairment(VCI) rats. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into normal group, sham-operated group, model group(VCI), control treatment group(VCI+ rTMS). The spatial learning and memory ability of rats was measured by Morris water maze. Electrophysiological recordings were conducted to detect the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS)on phenomena of synaptic transmission long-term LTP in dentate gyrus (DG) of hippocampus slices under the high frequency stimulation (HFS). Results In the escape latency after the 4th days, the rTMS treatment group was shortened to the model group (P<0.05).10 minutes later, the PS amplitude of the control treatment group increased and the LTP was enhanced, there were significant difference compared with model group(P<0.01). Conclusion The rTMS can improve VCI model rats learning and memory ablity by means of enhancing hippocampal LTP and the function of synaptic plasticity.

repetitive transcranial magnetic stimulation ；vascular cognitive impairment；hippocampus；learning and memory；long-term potentiation

路承彪，E-mail：2331202185@qq.com。

R 743.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.08.002

2016-11-30)