锁阳对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的防治作用

李珊，张珂，李国玉，王航宇，陈昱林，彭欢，王金辉,2*

（1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016）

锁阳对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的防治作用

李珊1，张珂1，李国玉1，王航宇1，陈昱林1，彭欢1，王金辉1,2*

（1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016）

为研究锁阳对四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠的治疗作用。采用将120只昆明小鼠随机分为6组，正常组、模型组、阳性对照组、锁阳提取物低、中、高给药组的方法。用CCl4和橄榄油的混合溶液进行造模，除了正常组，其它5组均腹腔注射10 mL/kg 6%CCl4，每周2次，连续8周，第5周对阳性对照组（水飞蓟宾胶囊0.2 g/kg）和锁阳给药组（0.15、0.3、0.6 g/kg）每天进行灌胃，正常组和模型组以同体积的生理盐水灌胃，连续4周。测定小鼠血清AST、ALT、LDH、和LN的含量，以及肝组织的SOD、GSH、MDA和Hyp的含量，称重并计算肝脏及脾脏指数。结果显示，与模型组相比较，锁阳给药组可明显降低肝纤维化小鼠血清的AST、ALT、LDH和LN的含量，降低肝纤维化小鼠肝组织的Hyp和MDA的含量，升高SOD和GSH的含量，并降低小鼠的脏器指数。由此可知，锁阳对四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠有治疗作用。

锁阳；四氯化碳；肝纤维化

肝纤维化（liver fibrosis）是大多数慢性肝脏损伤的最终病理结果［1-3］，因细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）的合成大于降解，导致其在肝脏内过度沉积引起。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）已被确定为细胞外基质的主要细胞来源，是引发肝纤维化的重要因素之一［4］，因此HSC的增殖活化是形成肝纤维化的重要环节，抑制HSC的增殖活化则有利于治疗肝纤维化［2-5］。通过研究已经发现肝纤维化的形成是一个可逆的过程［6］，在预防、治疗和逆转肝纤维化疾病中，中草药具有不可或缺的优势。目前，已经有多种中药应用于纤维化疾病的治疗中，如：丹参、莪术、百合、穿山甲、冬虫夏草等，能有效的抑制肝组织胶原纤维的增生，改善肝内微循环，发挥抗肝纤维化的作用，为肝纤维化疾病的治疗带来曙光。

锁阳是常用的传统中蒙药，又称为锁严子、锈铁棒、地毛球、琐阳、不老药，多寄生在蒺藜科白刺属植物的根部，主要分布于新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙古、陕西等荒漠地带。性甘、温，归肝经、肾经和大肠经，具有补肾壮阳、益肠通便的功效，用于腰膝痿软，阳痿滑精，肠燥便秘等疾病。其主要含有的化学成分为黄酮类［7］、萜类、甾体类、有机酸类、多糖类［8］、挥发性成分和鞣质等多种活性成分，使其具有抗缺氧、抗衰老、抗氧化［9］、抗疲劳［10］、增强免疫力、清除自由基［11］等作用。有研究报道通过对锁阳化学成分的研究，发现锁阳单体Songarin A对肝损伤细胞模型有干预作用［12］。本文通过采用腹腔注射10 mL/kg 6%CCl4诱导小鼠肝纤维化，来进一步研究锁阳对小鼠肝纤维化的治疗作用，为锁阳抗肝纤维化的临床运用、开发与研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性昆明种小鼠，体重20±2 g，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（新）2011-0001，在饲养一周适应环境后开始实验。

1.2 实验药物

锁阳购买于内蒙古，由石河子大学药学院谭勇副教授鉴定为锁阳Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉质茎。

提取方法：锁阳12 kg，砸碎后分别用 10倍、8倍、8倍量的60%乙醇提取3次，每次3 h，提取液浓缩得浸膏(4.078 kg)。

60%乙醇锁阳浸膏低剂量给药组：称取6 g的锁阳浸膏，加200 mL的双蒸水，配制成30 mg/mL的给药组，每只小鼠的给药量为0.15 g/kg。

60%乙醇锁阳浸膏中剂量给药组：称取12 g的锁阳浸膏，加200 mL的双蒸水，配制成60 mg/mL的给药组，每只小鼠的给药量为0.3 g/kg。

60%乙醇锁阳浸膏高剂量给药组：称取24 g的锁阳浸膏，加200 mL的双蒸水，配制成120 mg/mL的给药组，每只小鼠的给药量为0.6 g/kg。

水飞蓟宾胶囊阳性药对照组：称取4 g的水飞蓟宾胶囊，加200 mL的双蒸水，配制成20 mg/mL的给药组，每只小鼠的给药量为0.2 g/kg。

1.3 试剂

CCl4（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，批号20141108），水飞蓟宾胶囊（天津天士力圣特制药有限公司，批号：20161012），橄榄油为市售，谷丙转氨酶（ALT）（批号：20161227）、谷草转氨酶（AST）（批号：20161228）、乳酸脱氢酶 （LDH）（批号：20161221）、层粘连蛋白（LN）（批号：20161227）、丙二醛（MDA）（批号：20161227）、超氧化物歧化酶（SOD）（批 号 ：20161226）、 羟 脯 氨 酸 （Hyp）（批 号 ：20161225）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）（批号：20161226），测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio）（批号：20151226）购于北京索莱宝科技有限公司。

1.4 仪器

全自动多功能酶标仪（Therrno 3001，美国Thermo公司），UV-2600型紫外分光光度计（日本岛津公司），DHP-9162型电热恒温（北京市永光明医疗仪器厂），DHP-9126电热恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 肝纤维化模型的建立与给药

将雄性昆明小鼠喂养一周适应环境后，随机分为6组（正常组、模型组、阳性对照组、锁阳给药低、中、高组），每组20只。除了正常组，其它5组均腹腔注射10 mL/kg 6%CCl4，每周2次，连续8周。于造模第5周对阳性对照组（水飞蓟宾胶囊 0.2 g/kg）和锁阳给药组（0.15、0.3、0.6 g/kg）每天进行灌胃，正常组和模型组以同体积的生理盐水灌胃，连续4周。实验期间，所有小鼠定量喂食，自由饮水。每星期在喂食给药前对小鼠进行称重记录，并观察和记录小鼠毛色和行为活动。

1.5.2 取材

于第8周末次给药后，禁食24 h，摘眼球取血，常温静置1 h后3500 r/min离心10 min，取血清，保存于-20℃冰箱冷冻，用于血清指标的测定。采血后解剖小鼠，取肝脏、脾脏称重，计算脏器指数，然后将肝组织保存于-20℃冰箱用于肝组织测定指标。

肝组织标本：用生理盐水对小鼠的肝脏进行灌流，然后取出肝脏，放入10%的甲醛溶液中固定，用于HE染色。

1.6 指标的测定

1.6.1 用血清测定AST、ALT、LDH和LN含量，按试剂盒说明书操作，使用酶标仪进行测定

1.6.2 制备10%的肝组织匀浆液

称取肝组织，按重量（g）:体积（mL）=1∶9 的比例加入9倍体积的生理盐水，剪碎组织，冰水浴匀浆，3000 r/min，离心 10 min，取上清液，用于测定 TP、GSH、SOD、MDA和 Hyp的含量。

1.6.3 脏器指数

称取肝脏和脾脏的重量，计算脏器指数肝（脾）脏指数=脏器质量/小鼠体重×100%。

1.6.4 病理组织学观察

石蜡包埋，切片，HE染色观察肝纤维化小鼠的病理组织学变化。

1.6.5 统计学分析

运用SPSS 19.0对实验数据进行处理，实验结果以±S表示。使用one-way ANOVA比较组间差异。当P＜0.05时有显著性差异（具有统计学意义），当P＜0.01时有极显著性差异（具有统计学意义）。

2 结果

2.1 对肝纤维化小鼠脏器指数的影响

与正常组相比，模型组的肝脏指数明显升高（P＜0.01），锁阳低剂量和中剂量给药组的肝脏指数与模型组相比无显著性差异（P＞0.05），锁阳高剂量组和水飞蓟宾胶囊对照组的肝脏指数与模型组相比明显降低（P＜0.01）。与正常组相比，模型组的脾脏指数明显升高（P＜0.01），锁阳低剂量给药组与模型组相比无显著性差异（P＞0.05），锁阳中剂量组、高剂量组和水飞蓟宾胶囊对照组的脾脏指数与模型组相比明显降低（P＜0.05，P＜0.01）（表 1）。

表1 锁阳对肝纤维化小鼠脏器指数的影响Tab.1 Effect of Cynomorium Songaricum on organ indexes of hepatic fibrosis mice

2.2 对肝功能指标AST、ALT、LDH的影响

与正常组相比，模型组的AST、ALT、LDH含量明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，锁阳给药组和水飞蓟宾胶囊对照组 AST、ALT、LDH含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01），且锁阳给药组的疗效与给药剂量成正比关系（表2）。

表2 锁阳对肝功能指标AST、ALT、LDH的影响Tab.2 Effect of Cynomorium Songaricum on AST、ALT、LDH activities of Hepatic function index

2.3 对肝纤维化指标LN的影响

与正常组相比，模型组的LN含量明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，锁阳给药组和水飞蓟宾胶囊对照组LN含量明显降低（P＜0.01），且锁阳给药组的疗效与给药剂量成正比关系（图1）。

图1 锁阳对肝纤维化指标LN的影响Fig.1 Effect of Cynomorium Songaricum on LN activities of Hepatic fibrosis index

2.4 对肝组织Hyp的影响

与正常组相比，模型组Hyp的含量明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，锁阳给药组和水飞蓟宾胶囊对照组Hyp含量明显降低（P＜0.01），且锁阳给药组的疗效与给药剂量成正比关系（图2）。

图2 锁阳对肝组织Hyp的影响Fig.2 Effect of Cynomorium songaricum on Hypactivities in hepatic tissue

2.5 对肝组织抗氧化物酶和脂质过氧化产物 SOD、GSH、MDA的影响

与正常组相比，模型组MDA的含量明显升高（P＜0.01），SOD、GSH 活性明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，锁阳给药组和水飞蓟宾胶囊对照组MDA含量明显降低 （P＜0.05，P＜0.01），SOD、GSH 活性明显升高（P＜0.05，P＜0.01），且锁阳给药组的疗效与给药剂量成正比关系（表3）。

表3 锁阳对肝组织SOD、GSH和MDA的影响Tab.3 Effect of Cynomorium Songaricum on SOD、GSH、MDA activities in hepatic tissue

2.6 对肝脏病理组织学的影响

HE染色结果显示，正常组肝组织结构清晰，肝小叶完整，肝细胞索排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区仅有少量的纤维组织。模型组部分肝小叶结构紊乱，有大量炎症细胞浸润，并有假小叶形成，肝细胞普遍坏死，胶原纤维大量增生并形成纤维间隔。水飞蓟宾胶囊对照组肝纤维化情况有所好转，肝细胞索排列基本整齐，未见明显的纤维间隔形成，肝细胞坏死减少，炎症减轻，仅在汇管区看到少量纤维组织增生。锁阳低、中、高给药组与模型组相比，肝纤维化的现象有所好转，汇管区胶原纤维增生减少，纤维间隔变窄，肝细胞坏死程度减轻，炎症细胞浸润减少，且肝纤维化程度随给药剂量的增加而减轻（图3）。

图3 锁阳对肝纤维化小鼠肝脏病理组织学的影响（HE，×100）Fig.3 Effect of Cynomorium Songaricum on liver pathological histology in hepatic fibrosis mice（HE，×100）

3 结果与讨论

肝纤维化的本质是多种致病因素引起的肝损伤刺激伤口的愈合反应［13］，是ECM的合成与降解失衡，导致ECM在肝脏内过度沉积的结果［14-15］。ECM的大量沉积，引起胶原纤维增生，导致肝功能减退，形成肝硬化。肝纤维化的形成是一个复杂的过程，了解肝纤维化的形成机制，有助于预防和治疗肝纤维化。肝纤维化严重影响人们的健康和生活，寻找快速有效的手段治疗和逆转肝纤维化十分关键。

AST、ALT、LDH主要存在于肝细胞浆内，肝纤维化时，肝细胞受损坏死，细胞膜的通透性增加，从而使血清中AST、ALT、LDH的含量增加。实验结果显示，与CCl4诱导的模型组相比，锁阳给药组可降低小鼠血清中 AST、ALT、LDH的含量，从而保护肝细胞膜的功能并减少炎症细胞的浸润。LN是主要存在于基底膜透明层中的非胶原糖蛋白，是细胞外基质重要组成部分，肝纤维化时其含量增加，且参与引起肝窦毛细血管化，可反映汇管区纤维化程度及肝窦毛细血管化的情况，主要用于评价肝纤维化的严重程度。锁阳给药组与模型组比较，可明显减少血清中LN的含量，从而减轻小鼠肝纤维化的程度。

胶原是细胞外基质的主要成分，而Hyp是构成胶原组织的主要成分，是衡量机体胶原代谢及纤维化的重要指标。MDA是脂质过氧化物之一，研究证实MDA可促使胶原的形成，影响胶原组织的代谢从而阻碍肝功能，主要用于反映机体脂质过氧化程度，亦可反映机体肝脏受损情况。SOD、GSH可以清除机体过多的脂质过氧化物，其含量的高低反映机体的抗氧化物水平和清除自由基的能力。锁阳给药组与模型组相比，可明显降低小鼠肝组织中Hyp及MDA的含量，升高SOD、GSH的含量，减少胶原纤维的形成，增强机体抗氧化水平，清除自由基及脂质过氧化物的能力，从而减轻小鼠肝纤维化程度。

与CCl4诱导的模型组相比，锁阳给药组还可降低小鼠的肝脏和脾脏指数，减轻脏器的肿胀及脂质化程度。HE染色显示锁阳可明显改善小鼠肝纤维化程度，减少肝细胞坏死及炎症细胞的浸润，抑制胶原纤维的增生。

实验证明锁阳具有抗肝纤维化的作用，且治疗效果可能与提高机体抗氧化水平及清除自由基能力，并减少胶原纤维的产生，降低细胞外基质的沉积有关，但其作用的具体有效成分待进一步的探讨与研究。

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The preventive effect of Cynomorium Songaricum on carbon tetrachloride induced liver fibrosis in mice

Li Shan1,Zhang Ke1,Li Guoyu1,Wang Hangyu1,Chen Yulin1,Peng Huan1,Wang Jinhui2*
(1 School of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 School of Traditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang,Liaonin 110016,China)

To investigate the Cynomorium Songaricum treatment of liver fibrosis in mice induced by carbon tetrachloride(CCl4).120 male Kunming mice were randomly divided into 6 groups:the normal group,model group,positive control group,the low,middle and high dose Cynomorium Songaricum group.Models were built by intraperitoneal injection of 6%carbon tetrachloride(CCl4,10 mL),with olive oil,twice a week for eight weeks.From the 5th week,the positive control group was intragastric administrated with 0.2 g/kg Shuifeijibin capsule;and the Cynomorium Songaricum medicine groups were intragastric administrated with 0.15 g/kg,0.3 g/kg,0.6 g/kg corresponding drugs;the normal group and model group with same volume of normal saline lavage,for four weeks.Mice serum AST,ALT,LDH and LN,as well as the liver tissue SOD,GSH,MDA and Hyp were tested,and the liver and spleen index was calculated.Compared with model group,the level of AST,ALT,LDH,LN,the level of Hyp and MDA content and the organ index in Cynomorium Songaricum medicine groups were obviously reduced, while,the SOD and GSH content was increased.It is concluded that Cynomorium Songaricum has a therapeutic effect to the liver fibrosis induced by CCl4in mice.

Cynomorium Songaricum;Carbon tetrachloride;Liver fibrosis

R285.5

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.017

1007-7383(2017)03-0368-05

2017-02-25

国家科技支撑计划项目（2012BAI30B02），国家自然科学基金项目（81560566）

李珊（1991-），女，硕士研究生，专业方向为药理学。

*通信作者：王金辉（1972-），男，教授，从事药理学研究，e-mail:15999290001@163.com。