ING4在子宫内膜腺癌中的表达及与预后的关系

冯博，周莹，陈金玲，王英红

（石河子大学医学院第一附属医院妇产科，新疆 石河子 832000）

ING4在子宫内膜腺癌中的表达及与预后的关系

冯博，周莹，陈金玲，王英红

（石河子大学医学院第一附属医院妇产科，新疆 石河子 832000）

为检测生长抑制因子4（ING4）在不同子宫内膜组织中的表达，探讨其与子宫内膜腺癌临床病理参数和预后的关系。采用免疫组织化学法分别检测20例非瘤子宫内膜组织、38例非典型增生性子宫内膜组织、76例子宫内膜腺癌组织中 ING4的表达，结合术后随访资料，分析其表达与临床病理特征及预后的关系。结果显示，ING4在非瘤组子宫内膜组织中阳性表达率为100%,非典型增生性子宫内膜组织中表达阳性率为87.2%，而子宫内膜腺癌组织阳性表达率为55.3%，差异有统计学意义（P＜0.05）。ING4在不同组织分化程度、肿瘤组织大小的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。ING4蛋白的表达与患者的年龄、癌组织肌层浸润深度、有无血管浸润、肿瘤临床病理分期及有无淋巴结转移之间均无统计学意义（P＞0.05）。ING4表达阴性者 5年生存率与ING4阳性者 5年生存率差异没有统计学意义（P＞0.05）。由此可知，ING4的表达与子宫内膜腺癌的发生、发展有密切关系，检测ING4的表达对于子宫内膜腺癌的临床诊断有重要意义。

生长抑制因子4；子宫内膜腺癌；免疫组织化学

子宫内膜癌（endometrial carcinoma）是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以来源于子宫内膜腺体的腺癌最为常见，其发病率与死亡率均居女性生殖系统第二位，占女性全身恶性肿瘤第四位。然而，与大部分恶性肿瘤的发病率下降的趋势相反，子宫内膜癌的死亡率在2000年后随着其发病率上升也 呈上升 趋势［1］。

ING4是生长抑制因子（inhibitor of growth，ING）家族中的一员，因其在染色体的修饰、影响细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭、转移等过程中起着至关重要的作用，被认为是重要的肿瘤生长抑制因子。一些观察表明［2］ING4通过调节转录因子p53和NF-kappaB（NF-κB）在肿瘤发生的转录翻译阶段发挥着关键的调节作用。很多研究报道ING4在肿瘤发生的过程中表达下调，然而其在子宫内膜腺癌中的研究比较少，本实验应用免疫组化方法通过研究ING4在子宫内膜腺癌及正常子宫内膜组织中的表达差异，探讨其表达对子宫内膜腺癌发生、发展的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

一抗为兔抗人 ING4多克隆抗体（ab113425）购自英国 Abcam公司，免疫组化Envision染色试剂盒、PBS缓冲液粉剂、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2 标本

收集2008年1月-2013年1月在石河子大学医学院第一附属医院妇科手术并有病理诊断的子宫内膜组织蜡块，根据术后病理诊断进行分组，其中对照组为非瘤子宫内膜组织，共20例，病例组为非典型增生子宫内膜组织39例及子宫内膜腺癌组织76例。患者年龄分布为34-79岁，平均54.73岁。所有子宫内膜腺癌患者均符合：（1）初次手术；（2）所有患者术前均未接受放疗、化疗等辅助治疗；（3）原发性子宫内膜腺癌患者。随访时间为42-98个月，中位随访期为63个月。

1.3 免疫组化染色

应用免疫组化Envision两步法，对137例子宫内膜组织蜡块标本5μm厚连续切片，烤干，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，置于20%EDTA抗原修复缓冲液（ph9.0）中高温高压抗原修复8 min，自然冷却至室温。3%H2O2常温孵育10 min，滴加兔抗人ING4多克隆抗体（稀释度1∶600），4℃孵育过夜。滴加兔鼠通用型生物素化二抗及过氧化氢物标记的抗体；DAB显色，苏木精复染2 min，脱水透明封片。用已知阳性组织切片作阳性对照，用PBS溶液代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判定

ING4阳性反应产物主要表现为分布于细胞核和(或)细胞浆内的棕褐色颗粒［3-4］。每片均以高倍镜(×40)观察5个视野，每个视野约100个细胞，根据阳性细胞数及着色强度综合判断结果。根据细胞阳性率和阳性细胞的着色强度分别计分。细胞着色强度评分：无着色计为0分，浅棕黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分；按阳性细胞数所占百分比评分规则：阳性细胞数＜5%计为0分，6%-25%计为1分，26%-50%计为2分，51%-75%计为3分，76%-100%计为4分。ING4总分为阳性细胞百分比及着色强度相乘分级，所得分数 ＜3，(-)；3–5，(+)；6–9，(++)；＞9，(+++)［5］。最终得分(-)为阴性，(+)为弱阳性，(++)和(+++)为强阳性。

1.5 统计学方法

对ING4表达采用阳性率（%）进行描述，组间ING4表达阳性率的比较采用χ2检验或Fisher’s精确概率法，等级资料采用 Kruskal－Wallis H秩和检验进行统计学分析。采用Kaplan-Meier法比较组间生存曲线，用Log-Rank法行生存率差异性检验，以P＜0.05（双侧）认为差异有统计学意义。所有数据均用SPSS21.0统计软件包分析。

2 结果

2.1 ING4在不同子宫内膜组织中的表达情况

本实验免疫组化染色显示，ING4蛋白定位于细胞核和（或）细胞浆（图1），在非瘤组子宫内膜组织中阳性表达率为 100%（20/20），其中 95%（19/20）表达为强阳性，非典型增生性子宫内膜组织中表达阳性率为87.2%（34/38），其强阳性表达率仅占26.3%（10/38）。而子宫内膜腺癌组织阳性表达率为55.3%（42/76），未见强阳性表达，且在子宫内膜腺癌组织中发现，ING4在细胞核中的表达有着色面积减小、着色强度减轻的趋势。各组间ING4的阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 ING4在非瘤组子宫内膜组织、非典型增生子宫内膜组织和子宫内膜腺癌组织中的表达Tab.1 the expression of ING4 in different endometrial tissues

图1 ING4在不同子宫内膜组织中的阳性表达情况Fig.1 The positive expression of ING4 in different endometrial tissues

2.2 子宫内膜癌中ING4的表达与生物学行为的关系

子宫内膜癌中ING4的表达与生物学行为的关系见表2。

表2 ING4在子宫内膜腺癌表达及其与临床特征的关系 n/%Tab.2 Relationship among expression of ING4 and clinicopathologic factors of endometrial tissues

本实验分别研究分析了ING4表达与患者年龄、分化程度、癌组织肌层浸润深度、有无血管浸润、肿瘤大小、肿瘤临床病理分期及有无淋巴结转移之间的关系。结果表明，在子宫内膜腺癌组织中，ING4蛋白的表达与患者的年龄、癌组织肌层浸润深度、有无血管浸润、肿瘤临床病理分期及有无淋巴结转移之间均无统计学意义（P＞0.05）。ING4蛋白表达在子宫内膜腺癌高分化组的阳性表达率为76.2%（16/21），中分化组的阳性表达率为53.5%（23/43），低分化组的阳性表达率为 33.3%（4/12），三组间差异有统计学意义（P＜0.05）。ING4蛋白表达在子宫内膜腺癌肿瘤大小≤2cm的阳性表达率为67.5%（27/40），肿瘤大小＞2 cm的阳性表达率为41.7%（15/36），两组间差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

2.3 ING4的表达和子宫内膜腺癌患者生存时间的关系

随访日期截止到2016年7月31日，随访时间42-98个月。用ING4蛋白阳性表达病例和阴性表达病例进行生存分析，结果显示：ING4阴性表达组的中位生存时间为61.5个月，ING4阳性表达组的中位生存时间为66个月。ING4阴性者生存率为93.8%，ING4阳性者的生存率为91.9%，差异无统计学意义（ Log-rankχ2=0.003，P=0.955）。

3 讨论

子宫内膜癌（Endometrial Carcinoma，EC）是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以子宫内膜腺癌最常见。是女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一，约占女性癌症发病的7%，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%-30%。其平均发病年龄为60岁，其中75%发生于50岁以上妇女，近年来，子宫内膜癌在世界范围内的发病率有上升并呈年轻化的趋势［6］。

本实验结果显示，ING4蛋白在非瘤组子宫内膜组织中阳性表达率为100%，其中强阳性表达占95%，非典型增生性子宫内膜组织中阳性表达率为87.2%，强阳性表达率下降至26.3%。而子宫内膜腺癌组织阳性表达率为55.3%，未见强阳性表达，表明ING4的表达与子宫内膜腺癌组织的发生、发展成负相关，即在非瘤组子宫内膜组织中呈高表达，随着子宫内膜病变的发生及肿瘤恶性程度增高，ING4的表达逐渐下调。提示ING4蛋白在子宫内膜病变的发生过展过程中发挥抑制作用，ING4表达下调与子宫内膜腺癌的发生发展密不可分。Tapia［7］等检测了乳腺癌组织中ING4的基因表达，发现其中16.5%的患者呈现表达缺失。Liu［8］等研究了ING4基因在卵巢癌中的表达，发现其在mRNA及蛋白水平的表达均下调，与对照组比较，差异有统计学意义。ING4的表达在肺癌［9］、结肠癌［10］和胃肠道间质肿瘤［11］也呈现低表达的状态。众多研究均可表明ING4有抑制肿瘤细胞生长的用，与本实验结果相符。

本实验继而分析了ING4与子宫内膜腺癌临床特征的关系，结果表明，在子宫内膜腺癌组织中，ING4蛋白表达在不同肿瘤分化程度及肿瘤大小的差异有统计学意义。即ING4在子宫内膜腺癌高分化组的阳性表达率高于中分化组和低分化组的阳性表达率；在子宫内膜腺癌肿瘤大小≤2 cm的阳性表达率高于肿瘤大小＞2 cm的阳性表达率；而ING4蛋白的表达与患者的年龄、癌组织肌层浸润深度、有无血管浸润、肿瘤临床病理分期及有无淋巴结转移之间均无统计学意义。据研究［12］证明：肿瘤细胞分级情况对子宫内膜癌患者的生存期有显著影响，且本研究证实ING4的表达与肿瘤细胞分级成负相关，进一步提示ING4的表达与子宫内膜腺癌的发展及预后相关。亦有研究提出：在高度恶性胶质母细胞瘤中ING4mRNA的含量较正常脑组织下降6倍，而II-III级胶质母细胞瘤中的含量仅下降2-3倍［13］。提示ING4的低表达与肿瘤的发生、发展和侵袭相关，对于子宫内膜腺癌的临床治疗及预后有指导性意义。与本实验研究结果相符。蔡玉洁［14］等在ING4与子宫内膜癌的表达研究中得出结论，ING4的表达与组织学分级显著相关，而与肌层浸润深度、淋巴结转移无关，但因其RT-PCR结果显示，Ⅲ-Ⅳ期子宫内膜癌组织中 ING4的表达量显著低于Ⅰ-Ⅱ期，差异有统计学意义，这一结论与其ING4免疫组化结果相反，而本研究中，虽然ING4在FIGO分期Ⅰ-Ⅱ组的阳性表达率和Ⅲ-Ⅳ组的阳性表达率无统计学意义，但呈下降趋势，与蔡的结论中RT-PCR结果相一致，免疫组化结果相反，造成这一差异的原因考虑两个方面：一方面可能是由于样本量小导致的；另一方面由于本地区临床二级预防开展较好，疾病发现期别较早，晚期病变样本量小，从而影响了本研究的结果。

研究报道［10，15，16］ING4 的低表达与肿瘤的预后关系密切，本研究对76例子宫内膜腺癌患者进行回顾性分析，根据生存分析结果可以发现ING4阳性表达的子宫内膜腺癌的生存率有高于ING4阴性表达的趋势，然而ING4阳性表达病例组和阴性表达病例组的生存率的差异没有统计学意义，提示ING4的表达对于子宫内膜癌预后不具有指导意义。此结论与文献报道不一致，可能由于样本量小，存在一定偏倚和个体异质性，导致统计结果出现偏差。

综上所述，ING4可作为筛查子宫内膜病变的诊断指标之一，同时一定程度上可以参与指导临床上对子宫内膜腺癌的治疗及预后的判断。

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Expression and prognostic value of inhibitor of growth 4 in endometrial adenocarcinoma

Feng Bo，Zhou Ying，Chen Jinling，Wang Yinghong
（Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China）

To investigate the expression of ING4 in different endometrial tissues and the association with clinical pathological parameters and prognosis of endometrial adenocarcinoma.Expression of ING4 were detected in 20 cases of benign endometrial tissue,38 cases of atypical hyperplasia of endometrium and 76 cases of endometrial adenocarcinoma tissues by Immunohistochemical method,combined with postoperative follow-up data,the relationship between the ING4 expression and the clinical pathological features and prognosis was analyzed.The positive expression rate of ING4 was 55.3% in endometrial adenocarcinoma tissues,which was significantly lower than those of normal tissue samples and atypical hyperplasia endometrial tissues (100%and 87.2%respectively,P＜0.05).There were significant differences in the differentiation and tumor size.While the differences of the positive expression rates were not statistically significant in the ages,depth of invasion,vascular invasion,clinical pathologic stage and lymph node metastasis (P＞0.05).There was no significant difference in the 5 year survival rate between ING4 expression negative and positive patients.The expression of ING4 is strongly associated with the carcinogenesis and development of the endometrial adenocarcinoma,which suggests that ING4 might be used as prognostic marker for the endometrial adenocarcinoma．

Inhibitor of Growth 4;endometrial adenocarcinoma;Immunohistochemistry(IHC)

R711.74

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.016

1007-7383(2017)03-0363-05

2017-01-19

科技惠民计划专项项目（2013GS650104）

冯博（1990-），女，硕士研究生，专业方向为妇科肿瘤。

*通信作者：王英红（1960-），女，主任医师，从事妇科肿瘤、妇科内镜研究，e-mail：wyhxj920@sina.com。