小麦赤霉菌FGSG_03700基因敲除及功能研究

刘超頔 侯占铭

摘要 [目的]敲除小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）FGSG_03700基因，确定其缺失突变体表型，从而分析该基因的生物学功能。[方法]应用Split Marker基因敲除技术，构建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒，通过PEG介导，进行原生质体转化，在含有潮霉素的培养基上筛选转化子。[结果]通过PCR正负筛查，得到3个确定的突变体，分别命名为ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。通过表型验证及孢子对番茄侵染试验发现，敲除突变体的菌落形态及生长速度没有明显变化，致病力没有减弱，但突变体的产孢量低于野生型PH-1。[结论]FGSG_03700基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关。

关键词 小麦赤霉菌；Split Marker；基因敲除；FGSG_03700

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0149-07

Research on Knock-out and Function of FGSG_03700 Gene in Fusarium graminearum

LIU Chao-di， HOU Zhan-ming（College of Life Science and Technology， Inner Mongolia Normal University， Hohhot，Inner Mongolia 010020）

Abstract [Objective] To knock out FGSG_03700 gene in Fusarium graminearum and determine the phenotype of the knock-out mutants so as to analyze the biological function of this gene. [Method]By employing Split Marker gene knockout strategy， gene knock-out cassette containing hygromycin phosphotransferase gene hph was built and transformed into protoplast of wild type PH-1 by PEG-mediated method. [Result] Three mutants were screened by PCR positively and negatively screening named as ΔFGSG_03700 1-2， ΔFGSG_03700 2-2 and ΔFGSG_03700 2-3， respectively. The analysis of phenotype and tomato infection test revealed that there had no evident changes in colony morphology， growth rate and pathogenicity between the mutants and wild type. However， the spore quantity of mutants was significantly lower than PH-1.[Conclusion] FGSG_03700 gene is possibly related to the growth of spore in F.graminearum.

Key words Fusarium graminearum；Split Marker；Gene knock-out；FGSG_03700

小麥赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是在世界温暖潮湿和半潮湿地区麦田广泛发生的一种毁灭性病害[1]，其致病优势种为小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）[2]。由小麦赤霉菌在适宜条件下产生的有毒次级代谢产物，即真菌毒素，会导致作物产量锐减，降低谷物质量[3-5]。当其中产生的2种主要真菌毒素——脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）在人畜体内达到一定含量时，会严重危害人畜健康[6]。为了从遗传角度在根本上防治该病害的发生，通过基因敲除技术鉴别某些基因的致病力已成为一种理想的方式。目前，很多相关致病基因已被成功敲除、克隆和鉴定。如1997年敲除并鉴定了与毒素生物合成有关的Tri5基因[7]；2002年Hou等[8]发现了与雌性繁殖、异核体形成有关并在侵染寄主等过程中有重要作用的MGV1基因；2006年Shim等[9]发现了与真菌分泌毒素和雌性繁殖有关的FSR1基因；2011年吴彬[10]敲除FgAC1基因，发现它调控菌丝生长速度与色素合成等。

有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一[11]，MAPKs信号转导通路对各种生理过程的调控都具有生物进化的高度保守性，通常在大多数细胞内都存在着多条并行的MAPKs信号通路。该信号通路基因编码Ser、Thr和Tyr蛋白激酶，由MAP3K-MAP2K-MAPK组成，依次通过磷酸化将上游信号传递给下游应答分子[12]。MAPKs通路中基因的敲除及功能的鉴定大多是以酵母中的MAPK信号通路为依据的。酵母菌中5条MAPK信号级联通路分别调节酵母菌的接合生殖、菌丝生长、细胞壁整合、渗透胁迫和胞壁组装，其中的每条通路都相互独立，互不交联[13]。通过转录组测序分析得到敲除小麦赤霉菌中MAPK通路上的MGV1基因后的FGSG_03700基因为显著上调基因，通过基因敲除技术对FGSG_03700基因进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株。

小麦赤霉菌野生型PH-1菌株及质粒pCB1003[含潮霉素磷酸转移酶基因（hph）]均来源于美国普渡大学，现由内蒙古师范大学生命科学与技术学院分子生物学实验室保存。

1.1.2 引物设计。从小麦赤霉菌基因数据库（Fusarium comparative database）中查找FGSG_03700的基因序列[>F.graminearum PH-1（FG3）supercont 3.2 of Gibberella zeae PH-1[DNA] 2939077-2944798 +]，并下载FGSG_03700基因及其上下游2 000 bp的碱基序列，根据下载的基因序列以及hph的碱基序列设计构建基因敲除盒时所需的PCR引物和检测所需的目的基因内部引物，该试验引物由上海生工技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

1.1.3试剂、酶及培养基。潮霉素（Hygromycin B，50 mg/mL）、Chitinase（几丁质酶）、Driselase（崩溃酶）、Lysing enzyme（溶菌酶）均购自Sigma公司；2×Taq PCR Master Mix购于南京博尔迪公司；真菌基因组DNA提取试剂盒（BioFlux）；普通质粒小提试剂盒（离心柱型，TIANGEN）；10×TBE电泳缓冲液、STC buffer、PTC buffer、1.2 mol/L KCl溶液、原生质体（Protoplasting）缓冲液、CMC培养基、YEPD液体培养基、TB3液体培养基、TB3固体培养基、LB液体培养基、LB固体培养基、TCC培养基等[10]。

1.2 方法

1.2.1 pCB1003质粒DNA的提取。从LB固体培养基上挑取该质粒单菌落接种于3 mL LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min振荡培养12 h左右。之后将菌液转移至1.5 mL离心管，12 000 r/min离心1 min，保留沉淀。之后的提取步骤按照普通质粒小提试剂盒（离心柱型，TIANGEN）中的提示进行，得到pCB1003的质粒DNA并对其进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 小麦赤霉菌野生型菌株PH-1基因组DNA的提取。将在TCC固体培养基上活化3 d后的野生型小麦赤霉菌PH-1的菌丝接种于YEPD液体培养基中（含Ampicillin），25 ℃、175 r/min振荡培养4 d。用无菌双层miracloth过滤该培养基后保留菌丝，用灭菌的滤纸吸干多余的培养液，并将菌丝用锡纸包好，-80 ℃过夜保存后将其从冰箱中取出置于液氮中迅速研磨至粉末状。之后的操作严格按照真菌基因组DNA提取试剂盒的提示进行，得到PH-1基因组DNA并对其进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 FGSG_03700基因敲除盒的构建——Split Marker法。以提取的PH-1基因组 DNA为模板，FGSG_03700 1F/FGSG_03700 2R和FGSG_03700 3F/FGSG_03700 4R为引物对FGSG_03700基因上下游序列进行PCR扩增。以提取的pCB1003质粒DNA为模板，HYG/F-HY/R和YG/F-HYG/R为引物对Hygromycin（hph）基因上下游序列进行PCR扩增。Split Marker重疊PCR扩增时分别以FGSG_03700基因上游PCR扩增产物和hph基因上游PCR扩增产物为模板，FGSG_03700 1F-HY/R为引物；FGSG_03700基因下游PCR扩增产物和hph基因下游PCR扩增产物为模板，YG/F-FGSG_03700 4R为引物进行PCR扩增。所有PCR过程注意选择适宜的退火温度及延伸时间，对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 FGSG_03700基因敲除——原生质体的制备与转化。将在TCC固体培养基上活化3 d的野生型小麦赤霉菌PH-1的菌丝接种于CMC液体培养基中，25 ℃、175 r/min振荡培养4 d。使用无菌双层miracloth将含有孢子的液体过滤后并离心5 min，将沉淀的孢子用YEPD液体培养基重新悬起并全部转移到该培养基中，25 ℃、175 r/min振荡培养12 h，此时需严格控制时间。12 h后用无菌双层miracloth过滤，并用1.2 mol/L KCl冲洗4次后用灭菌药勺将收集到的菌丝放入50 mL无菌离心管中，将现配制好的原生质体Buffer过滤灭菌到装有菌丝的离心管中，30 ℃、80 r/min振荡培养约2 h。显微镜下制片观察原生质体释放情况，达到要求后用无菌双层miracloth将原生质体过滤至三角瓶中，取70 mL的1.2 mol/L KCl溶液冲洗滤布至瓶内液体为100 mL，25 ℃、4 000 r/min，离心5 min。弃上清，加STC buffer悬浮沉淀并定容至50 mL，混合均匀，25 ℃、4 000 r/min，离心5 min。弃去上清液，加600 μL STC buffer轻轻将沉淀悬起，混合均匀后冰浴6 h。将FGSG_03700基因的重叠PCR产物上下游各取10、300 μL原生质体混合于15 mL无菌离心管中，轻轻混匀后室温静置20 min。之后取1.25 mL 40% PTC buffer加入该离心管并混匀，室温静置20 min。最后向该离心管中加入5 mL TB3液体培养基（含有50 μg/mL Ampicillin），25 ℃、80 r/min振荡培养15 h。

1.2.5 ΔFGSG_03700转化子的筛选及鉴定。将振荡培养的原生质体取出，25 ℃、4 000 r/min离心5 min，弃去上清液后向离心管中加入10 mL LMT agar TB3固体培养基（含有终浓度250 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin），与原生质体混合均匀后倒入灭菌的90 mm培养皿内，25 ℃过夜培养。之后再向其中加入10 mL LMT agar TB3固体培养基（含有终浓度250 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin），25 ℃继续培养。3～4 d后长出单菌落转化子，分别挑取转化子接种到TCC固体培养基（含有150 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin）上继续筛选。选取与在TCC固体培养基（含有50 μg/mL Ampicillin）上生长的小麦赤霉菌野生型PH-1单菌落表型有差异的转化子提取其基因组DNA。之后以提取的转化子基因组DNA及野生型PH-1基因组DNA作模板，HYG/F-HYG/R、FGSG_03700 1F-HY/R作引物进行PCR正筛，FGSG_03700 N1F/N2R作引物进行PCR负筛，并对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，只有正负筛选扩增出的条带均符合预期结果的转化子才能被确定为正确的敲除突变体。

1.2.6 FGSG_03700敲除突变体表型观察和致病力检测。挑取野生型PH-1和敲除突变体FGSG_03700的相同大小的菌丝分别接种于60和90 mm装有TCC培养基（含50 μg/mL Ampicillin）的培养皿中心，每个菌种各做3个重复，25 ℃，培养3～4 d，观察60 mm培养皿中菌株生长过程中的形态变化；测量90 mm培养皿中菌株的生长速度，即菌落直径。将野生型和敲除突变体菌株分别接种于CMC培养基中，每个菌株各做3个重复，25 ℃、175 r/min振荡培养4 d后制片，显微镜下观察不同分生孢子之间的形态有无不同。之后用无菌双层miracloth过滤，用血球计数板对含有孢子的滤液进行计数。对洗净的番茄用75%的乙醇消毒处理，再向其中分别注入10 μL 含有PH-1和ΔFGSG_03700孢子的滤液，深度约1.5 cm，标记，25 ℃静置培养4 d后，对比二者对蕃茄的侵染情况并拍照记录，各做3个重复。

2 结果与分析

2.1 pCB1003质粒DNA 取5 μL所提质粒DNA进行0.7%脂糖凝胶电泳检测，以1 kb plus DNA ladder为Marker，目的DNA片段长度在4 000～5 000 bp，结果符合预期片段大小（图1）。

2.2 野生型小麦赤霉菌PH-1基因组 DNA 取5 μL所提小麦赤霉菌基因组DNA进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，以1 kb plus DNA ladder为Marker，目的DNA片段长度符合预期结果（图2）。

2.3 FGSG_03700基因上下游PCR扩增序列

以野生型小麦赤霉菌PH-1菌株的基因组DNA为模板，分别以FGSG_03700 1F/FGSG_03700 2R和FGSG_03700 3F/FGSG_03700 4R为引物对FGSG_03700基因的上、下游序列进行PCR扩增，之后取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝膠电泳检测，以1 kb plus DNA ladder为Marker。上游目的片段长度约为575 bp，下游目的片段长度约为649 bp，结果符合预期片段大小（图3）。

2.4 hph基因上下游PCR扩增序列 以pCB1003质粒DNA为模板，分别以HYG-F/HY-R和YG-F/HYG-R为引物对hph基因的上、下游序列进行PCR扩增，之后取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，以1 kb plus DNA ladder为Marker。上游目的片段长度约为764 bp，下游目的片段长度约为931 bp，结果符合预期片段大小（图4）。

2.5 Split marker重叠PCR扩增序列 以FGSG_03700基因上游PCR产物和hph基因上游PCR产物为模板，以FGSG_03700 1F和HY/R为引物进行PCR扩增，预期片段长度为1 339 bp；以FGSG_03700基因下游PCR产物和hph基因下游PCR产物为模板，以YG/F和FGSG_03700 4R为引物进行PCR扩增，预期片段长度为1 580 bp。之后取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，以1 kb plus DNA ladder为Marker，结果符合预期片段大小（图5）。

2.6 敲除FGSG_03700基因转化子的PCR正负筛选 将HYG/F和HYG/R、FGSG_03700 1F和HY/R这2对引物用于PCR正向筛选，引物HYG/F和HYG/R扩增产物长度应为1 380 bp，引物FGSG_03700 1F和HY/R扩增产物长度应为1 339 bp，由于敲除突变体中FGSG_03700基因已被hph基因替代，因此在PCR过程中，只有以正确的敲除突变体为模板才能扩增出目的片段，电泳结果有预期条带，而以野生型PH-1为模板不能扩增出任何片段，电泳结果没有条带。以FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R为引物进行的PCR负向筛选，由于引物FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R设计于FGSG_03700基因内部，扩增产物长度应为788 bp，故成功敲除FGSG_03700基因的突变体不再含有该基因，以其为模板进行的PCR扩增不会出现引物FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R之间的片段，电泳结果没有条带，而野生型PH-1内仍含有此基因片段，因此以PH-1为模板会扩增出目的片段，电泳结果有预期条带（图6～8）。

2.7 FGSG_03700基因敲除转化子的筛选鉴定

2.7.1 菌落形态。对比在60 mm培养皿中的TCC培养基上生长4 d的野生型PH-1和敲除突变体ΔFGSG_03700的菌落生长情况，发现二者之间的生长过程及形态无显著差异（图9）。

2.7.2 菌落生长速度。连续4 d每24 h 1次对培养于90 mm培养皿中的TCC培养基上的野生型PH-1和敲除突变体ΔFGSG_03700的菌落直径进行测量与记录，绘制生长曲线图，发现敲除突变体ΔFGSG_03700的生长速度与野生型菌株PH-1基本没有差别（图10）。

2.7.3 产孢量的变化。分别吸取10 μL 在CMC培养基中培养4 d的PH-1和ΔFGSG_03700的分生孢子，用血球计数板进行计数，结果显示敲除突变体ΔFGSG_03700的孢子数量明显减少。野生型菌株PH-1的分生孢子量平均为2.5×106个/mL；敲除突变体ΔFGSG_03700 1-2的分生孢子量平均是1.0×106个/mL；敲除突变体ΔFGSG_03700 2-2的分生孢子量平均是1.1×106个/mL；敲除突变体ΔFGSG_03700 2-3的分生孢子量平均是1.0×106个/mL。由此看来，敲除突变体的孢子数比野生型明显减少。

2.7.4 分生孢子形态观察。用光学显微镜观察在CMC培养基中生长4 d的野生型菌株PH-1和敲除突变体ΔFGSG_03700的孢子形态，发现二者在形状、横膈膜数量、大小等方面基本没有差别。分生孢子的形态均为镰刀形，其横膈膜数为3～7个。显微镜拍照对比结果如图11所示。

2.7.5 分生孢子对蕃茄侵染试验。分别吸取10 μL在CMC培养基中培养4 d的PH-1和ΔFGSG_03700的分生孢子注入到新鲜的番茄中，培养4 d后观察到野生型菌株PH-1与ΔFGSG_03700孢子注入的周围区域都出现腐烂，且注入部位均长出白色菌丝，说明二者均可以侵染番茄，但从腐烂面积来看，二者侵染差异不显著（图12）。

3 讨论与结论

通过PCR扩增及Split Marker技术构建好基因敲除盒，利用同源重组原理及PEG介导法进行原生质体转化，使得hph基因取代野生型PH-1中的FGSG_03700基因得到预期的敲除突变体。首先，通过抗药性的初步筛选，在含有潮霉素的培养基上可以存活并生长的均为转化子。然后单独将每一个转化子培养在含有潮霉素的TCC培养基中，提取转化子DNA进行PCR验证以进一步确定目的突变体，采用3组引物进行正负筛查，同时符合3组引物筛查结果的被确认为敲除突变体ΔFGSG_03700。由于小麦赤霉菌营养体是单倍体，故敲除突变体的表型不涉及显隐性关系，可以直接表达。一般情况下，敲除突变体会有一些区别于野生型的由被敲除基因控制的表型改变。以野生型PH-1作为对照，ΔFGSG_03700敲除突变体的菌落形态无显著差异；菌落的生长速度基本与野生型持平；从分生孢子对番茄侵染能力的检测结果发现：二者的侵染面积大致相同，所以FGSG_03700基因的缺失不影响小麦赤霉菌的致病力；敲除突变体的分生孢子形态没有变化，但产孢量减少，由此推断FGSG_03700基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关。

该试验通过对敲除突变体的抗药性筛选以及3组PCR正负筛查，最终得到3个FGSG_03700基因的敲除突变体，分别为ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。将敲除突变体和野生型菌株在表型、生长速度、孢子形态、产孢量和致病力方面进行对比，发现敲除突变体ΔFGSG_03700在生长过程中，菌丝的生长速度及形态与野生型没有明显区别，对以番茄为寄主的侵染能力也没有下降，分生孢子形态没有变化，但产孢量减少。由此推斷FGSG_03700基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关，但该基因的功能尚未完全确定。

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