进境百合种球中镰刀菌的分离鉴定

李敏 宋蕴哲 虞赟 陈智明 刘国坤 沈建国

摘要 [目的]从日本进境百合种球中发现带有褐色、不规则病斑的种球，对其进行病原菌分离培养，以明确其病原种类及分类地位。[方法]通过菌落形态特征观察、ITS序列分析、致病性测定对该分离物进行鉴定。[结果]该分离物接种百合种苗引起枯萎反应，ITS序列和层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）的序列相似性为100%，结合分离物的菌落特征和孢子特征将病原菌鉴定为层出镰刀菌。[结论]引起百合种球病斑的病原菌为层出镰刀菌。

关键词 百合；种球；层出镰刀菌；鉴定

中图分类号 S41；S436.8 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0008-03

Identification of Fusarium proliferatum in Introduced Lily Bulbs

LI Min1， SONG Yun-zhe2， YU Yun1， SHEN Jian-guo1* et al

（1.Inspection and Quarantine Technology Center， Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou， Fujian 350000；2.College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forest University， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract [Objective] The pathogene was isolated and cultured from the lily bulbs introduced from Japan which had brown and irregular disease spot， so as to determine its taxonomic status. [Method] The pathogene were identified by pathogenicity determination，morphology observation and ITS sequence analysis. [Result] The ITS sequence of the pathogen causing wilt in lily identity of 100% with Fusarium proliferatum published in GenBank. [Conclusion] The results indicated that the pathogene isolated from the lily bulbs with black brown and irregular disease spot were F. proliferatum.

Key words Lily；Bulbs；F. proliferatum；Identify

鐮刀菌可引起百合枯萎病，是影响百合生产的重要病害之一[1]。该病原菌主要侵染百合肉质根或鳞茎盘基部，引起肉质根和盘基变褐腐烂，并可向上发展导致鳞片出现褐色凹陷病斑，后期鳞片从盘基散开并剥落。罹病鳞茎的植株明显矮化，叶片由上而下黄化，最后枯萎而死[2]。2016年福建出入境检验检疫局从日本进境的百合种球中发现带有褐色、不规则病斑的种球，对其进行病原菌分离培养，利用菌落形态特征观察、ITS序列分析、致病性测定对该分离物进行了鉴定，旨在为百合枯萎病的研究与防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为日本进境百合种球，进境时间为2016年3月。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离。

选取有病斑的感病种球进行病原菌分离。种球病斑部位用70%乙醇表面消毒，切取病健交界处的组织，置入5% NaClO消毒3 min，无菌水漂洗3次后，将组织切成小块接种于PDA培养基平板上，25 ℃培养。取菌落边缘的菌丝进行纯化3次后用于后续试验。

1.2.2 致病性测试。

将培养基上的分离物用灭菌水稀释后制成悬浮液，以孢子悬浮液作为接种体，采用灌根接种法接种百合幼苗植株。接种后用塑料袋罩好，置于25 ℃生化培养中保湿48 h。去掉塑料袋，将植株移至温室正常生长，以灭菌水为对照，观察植株的发病情况。

1.2.3 形态学鉴定。

观察菌落在PDA培养基上的颜色和形态，在光学显微镜下观察病原菌的分生孢子梗、分生孢子、分生孢子器的形状和颜色，测量其大小，并显微拍摄。根据病原菌的形态特征，进行病原菌种类的鉴定，以明确病原菌的分类地位。

1.2.4 分子生物学方法鉴定。

1.2.4.1 总DNA提取。

将PDA培养基上的菌丝挑至1.5 mL分离管中，采用植物基因组提取试剂盒（TIANGEN公司，DP305-02）提取病原菌总DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.4.2 ITS区PCR扩增。

采用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）/ ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补至25.0 μL。反应循环程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。

取10.0 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，核酸染料染色后用凝胶成像系统分析。扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，所得序列经Contig软件进行正反向拼接、人工校对后提交到NCBI数据库进行Blast，与GenBank中的核酸序列进行比对与同源性分析，确定菌株类别。

2 结果与分析

2.1 菌落形态特征

从百合种球的褐色、不规则病斑中分离出1株分离物（图1），编号为bh-1，PDA培养基上菌落白色，圆形，菌丝疏松如絮状，基底粉色，略带紫色（图2）。分生孢子梗瓶颈状（图3）。小型分生孢子较多，卵圆形至长圆形，有0～1个分隔，大小为（4.7～12.1） μm×（1.4～3.9） μm，着生于分生孢子梗上，常在瓶梗顶端聚成球团；大型分生孢子较少，纺锤形或镰刀形，较粗壮，稍弯曲，有3～5个分隔，大小为（17.3～ 40.7） μm×（2.1～4.8） μm（图4）。

2.2 致病性测试

将孢子悬浮液接种到健康百合幼苗植株上，7 d后叶片顶部黄化，随后叶片由上而下黄化、萎蔫，15 d后枯萎而死。从接种发病的病株上分离获得一致的病原菌，无菌水对照植株未出现症状（图5）。

2.3 序列分析

利用真菌通用引物ITS/I4TS5对分离物bh-1提取的DNA进行扩增，PCP扩增产物双向测序后拼接得到557 bp的序列（图6）。将该序列提交到NCBI上进行Blast比对，分离物bh-1与GenBank中Fusarium proliferatum（登录号：KJ767073、EU151484、FJ040179）的ITS区序列同源性均达100%。结合菌落、分生孢子、培养性状等形态学特征和ITS区的DNA序列分析，确定分离物bh-1为层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）。

3 结论与讨论

近年来，随着物质文化生活水平的不断提高，人们对各种苗木、花卉和盆栽等景观植物的需求不断增长，越来越多的游客在进境或邮寄包裹时携带花卉种子、种球及植株等。镰刀菌属是进境水果、种苗等植物产品中经常截获的有害生物，而长期以来该属病原菌的命名较混乱，加之其病原菌种类较多，传统的形态学鉴定方法为真菌分类研究提供了必要前提，但存在外界因素和人为因素的局限性，尤其分離培养物的培养性状不典型或者不产孢时，为该菌的口岸检疫鉴定工作增加了一定困难。

镰刀菌属真菌可侵染农作物、观赏植物等100余种，引起植物根腐、茎腐、穗腐等多种病害，导致植物萎蔫死亡[3]。层出镰刀菌又称层生镰刀菌或再育镰刀菌，该菌寄主广泛，可侵染玉米、向日葵、大蒜、瓜类等多种作物及观赏植物[4-7]。国内对百合病害的研究中少有报道该菌，前人报道了云南百合、龙牙百合、甘肃百合、江西百合枯萎病的主要致病菌均为尖孢镰刀菌[1，8-10]；李诚等[11]报道兰州百合枯萎病病原为尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌（F.rnoniliforme）和茄腐皮镰刀菌（F.solani）。在国外研究中，Prados-ligero等[12]报道了 Fusarium proliferatum引起西班牙百合枯萎病。该研究采用真菌利用ITS通用引物，扩增百合种球中分离物bh-1的DNA，扩增产物进行测序，所得序列与GenBank中的核酸序列进行比对，初步确定病原菌种类，结合菌落、分生孢子、培养性状等形态学特征，查阅相关文献资料，确定分离物bh-1为层出镰刀菌（F.proliferatum），这与Prados-ligero等[12]的研究结论一致。该研究将传统的形态学鉴定和分子生物学技术相结合，可以快速地对层出镰刀菌进行鉴定，兼顾鉴定检疫的效率和质量，为层出镰刀菌的鉴定和进境口岸检疫提供理论依据。

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