应用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E—6基因

宋琳娜 杨鹏九 万秀清 乔婵 潘洪杏 郭振楠 刘侠 郭兆奎 李若

摘要 [目的]利用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E-6基因，为提高优质烤烟品种K326 的马铃薯Y病毒（PVY）抗性提供材料。 [方法]构建特异靶向烟草eIF4E-6基因的TALENs载体，并由农杆菌介导转化K326烟草，用PCR和克隆测序方法筛选目的基因被成功编辑的T0代转基因烟株。 [结果]构建了2个特异靶向eIF4E-6基因的TALENs载体T3和T4。2个载体各获得了约40和50株阳性转化的K326 T0代烟株。T3载体获得1株目的基因靶位点发生大片段碱基缺失的杂合突变型T0代单株、3株靶位点发生碱基替换的杂合突变型T0代单株。T4载体获得5株靶位点发生碱基替换的杂合突变型T0代单株。 [结论]利用TALENs技术获得的eIF4E-6基因杂合突变型K326 T0代单株为后续获得纯合基因敲除的K326烟草，并最终获得PVY病毒抗性改良的K326烟草材料奠定了基础。

关键词 烟草；PVY；K326；eIF4E-6基因；TALENs

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0142-05

The Directional Knockout of eIF4E-6 Gene Using TALENs Technique

SONG Lin-na1，2，YANG Peng-jiu3，WAN Xiu-qing2，LI Ruo2* et al （1.Mudanjiang Normal University，Mudanjiang，Heilongjiang 157100；2.Mudanjiang Tobacco Science Research Institute，Mudanjiang，Heilongjiang 157011；3.Heilongjiang Tobacco Monopoly Bureau，Harbin，Heilongjiang 150010）

Abstract [Objective] To knockout eIF4E-6 gene using TALENs technique，and to provide material for improving the PVY resistance of high-class flue-cured tobacco cultivar K326.[Method] TALENs vectors that specifically targeting against eIF4E-6 gene were constructed.TALENs vectors transformed tobacco cultivar K326 mediated by Agrobacterium tumefaciens.The T0 transgenic tobacco plants of which eIF4E-6 gene were successfully edited were screened.[Result] Two TALENs vectors which specifically targeted against eIF4E-6 gene were constructed in this study.Two vectors obtained approximately 40 and 50 positively transformed T0 tobacco plants respectively.Vector T3 obtained 1 heterozygous mutant T0 plant whose targeting site of eIF4E-6 gene showed deletion of big base fragment and 3 heterozygous mutant plants whose targeting sites showed single base substitution.Vector T4 obtained 5 heterozygous mutant T0 plants whose targeting sites showed single base substitution.[Conclusion] These heterozygous mutant T0 K326 tobacco plants obtained by using TALENs technique laid foundation for obtaining homozygous gene knockout K326 tobacco and finally obtaining K326 tobacco with improved PVY resistance.

Key words Tobacco；PVY；K326；eIF4E-6 gene；TALENs

马铃薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）是近年来危害烟草生产的重要病害之一，严重影响烟草的产量和质量[1]。培育烟草PVY抗病品种是解决这一病毒性病害的有效途径。前期研究中，从普通栽培烟草中鉴定了一个真核生物翻译起始因子4E（Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E，eIF4E）基因家族成员eIF4E-6基因，基因功能研究结果表明其为烟草PVY病毒的感病基因。可见，通过基因组编辑技术敲除烟草PVY感病基因eIF4E-6来培育PVY抗病烟草成为可能。

转录激活样效应因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）技术是近年新兴的基因组编辑技术，已在动植物的基因组改造、基因功能研究等各个生物技术领域得到广泛应用。TALENs通过DNA识别模块靶向特异性的DNA位点并结合，然后由其Fok Ⅰ 核酸酶切断该位点的DNA双链。DNA双链断裂触发生物细胞固有的DNA损伤修复机制，细胞或通过非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）的方式在靶位点DNA引入一定数目的碱基删除、插入以实现对目的基因的敲除，或在提供供体模板的情况下通过同源修复（Homology-Directed Repair，HDR）的方式對靶位点DNA实现点突变、片段或基因的替换、敲入。由于TAL蛋白的DNA特异识别单位是间隔32个恒定氨基酸残基的二联氨基酸，而二联氨基酸与A、G、T、C 这4个核苷酸碱基具有一一对应关系，因此利用模块化的串联TAL蛋白就可以靶向任意DNA序列。该研究利用TALENs技术对烟草eIF4E-6基因进行特异性敲除，以期改良优质烤烟品种K326的PVY抗病性。

1 材料与方法

1.1 材料

烤烟品种K326种子由牡丹江烟草科学研究所提供。特异靶向普通烟草eIF4E-6基因的TALENs载体PTALED-LR（分别命名为T3及T4）订购自北京唯尚立德生物科技有限公司（图1）。MS（Murashige & Skoog Medium）及1/2 MS植物组织培养基购自Duchefa Biochemie公司（荷兰）。潮霉素B（Hygromycin B）购自Roche公司（瑞士）。质粒DNA小量纯化试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0）、植物基因组DNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit）、DNA片段纯化试剂盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0）、pMD18-T载体、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α Competent Cells）、农杆菌感受态细胞（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells）、普通Taq酶（TaKaRa TaqTM）、Ex Taq酶（TaKaRa Ex Taq）均购自宝生物工程（大连）有限公司。该研究所用PCR引物及序列见表1，所有引物由上海立菲生物技术有限公司（北京）合成。 其他试剂为化学分析纯。

1.2 方法

1.2.1 构建靶向eIF4E-6基因的TALENs载体。

首先确定目的基因的靶序列。①根据TALENs载体靶序列选择原则，TALENs识别臂识别碱基数量为16～18，识别位点第0个碱基为T或者C，间隔序列为14～18个碱基；②根据在线Blast及与中国烟草基因组数据库数据比对情况，确定eIF4E-6基因的特异靶位点2个，分别命名为T3和T4，靶位点序列信息见表2。根据靶位点序列，由北京唯尚立德生物科技有限公司合成TALENs载体，并用荧光素酶（Luciferase）单链退火（Single Strand Annealing，SSA）报告基因方法检测TALENs载体的体外DNA剪切活性。

1.2.2 TALENs载体遗传转化K326烟草。

首先将TALENs载体质粒电击转化农杆菌，具体步骤如下：将1 μg质粒放入解冻后的农杆菌LBA4404感受态细胞中，冰浴30 min；将混合液移入电击杯中，2 500 V/6 ms进行电击；然后加入500 μL SOC培养基，28 ℃、170 r/min振荡培养60 min；取150 μL菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上，28 ℃培养2～3 d至单菌落出现。挑取单菌落进行菌落PCR验证。菌落PCR 反应体系为总体积20 μL，其中10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 1.6 μL，无菌水14.1 μL，上下游引物（TEST-F和TEST-R各10 μmol/L）各0.5 μL，r-Taq酶0.3 μL，菌液1 μL。PCR扩增条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸6 min。PCR反应完成后进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。扩增载体潮霉素B抗性标签的PCR产物大小为801 bp。

其次制备K326烟草无菌苗，具体步骤如下：将K326烟草种子放入灭菌的1.5 mL离心管中，用0.2%升汞消毒5 min，无菌水冲洗3～5次，按8粒/瓶播种于1/2 MS固体培养基 （MS大量元素减半+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH=5.8）上，培养条件为25 ℃，光照16 h/d。

最后采用叶盘法转化K326烟草，具体步骤如下：待无菌苗长出4片叶子后，剪成约5 mm × 5 mm的小块，用MS固体培养基预培养2 d。扩繁转化成功的菌液，离心后用1/2 MS液体培养基重悬菌体。用重悬的菌液侵染烟草叶盘5 min，然后将被侵染的烟草叶盘置于含有2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS固体培养基中，23 ℃暗培养2 d。共培养后，在培养基中添加500 mg/L头孢曲松钠和10 mg/L潮霉素B进行筛选，诱导抗性愈伤组织的产生。待不定芽长到1～2 cm时，切下不定芽并转移到含250 mg/L头孢曲松钠和10 mg/L潮霉素B的生根培养基上进行生根培养后获得T0代K326烟株。

1.2.3 筛选T0代阳性转基因K326烟株。

分别取T0代K326烟株和非转基因对照烟株鲜嫩叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒提取烟草叶片DNA，以此为模板进行PCR检测。PCR反应体系为10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（hygromycinB-F2和hygromycinB-R2各10 μmol/L）各1 μL，普通Taq酶0.25 μL，模板DNA 1 μL，加无菌水至25 μL。PCR扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。扩增潮霉素B载体抗性标签，预期PCR产物大小为968 bp，在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.4 T0代K326烟株eIF4E-6基因突变检测。以T0代K326烟株叶片DNA为模板，进行PCR反应检测突变。PCR反应体系为10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（eIF4E6TALEN4&5-F2和eIF4E6TALEN4&5-R2各10 μmol/L）各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，无菌水17.25 μL，模板DNA 1 μL。 PCR 扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR反应完成后取少量PCR产物进行1%的琼脂糖凝膠电泳检测。用DNA片段纯化试剂盒纯化剩余PCR产物，然后将纯化的PCR产物连接到pMD-18T载体，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选每板挑取10个阳性菌落，摇菌后送上海立菲生物技术有限公司（北京）测序。用DNAMAN6、DNASTAR7等序列分析软件分析T0代K326烟株eIF4E-6基因在TALENs靶位点处产生DNA序列和相应氨基酸序列改变的情况。

2 结果与分析

2.1 TALENs载体体外DNA剪切活性检测

采用Luciferase-SSA报告基因方法对构建的2对TALENs载体T3和T4进行体外DNA剪切活性检测，结果如图2所示。相对于阴性对照，T3及T4载体的相对荧光强度分别达3.7倍和5.4倍，说明2个载体对相应靶位点DNA均具体外剪切活性，可以用于体内试验。

2.2 K326烟草的遗传转化

TALENs载体电击转化农杆菌，菌液PCR检测载体上的潮霉素B抗性标签，结果如图3所示。2个载体转化的菌落均扩增出约800 bp大小的条带，与预期801 bp大小PCR产物相符，说明载体已成功导入农杆菌。

2.3 T0代阳性转基因K326烟株的筛选 经潮霉素B抗性筛选，最终2个TALENs载体各获得约50和80株T0代再生K326烟株。提取再生烟株及非转基因K326烟草叶片DNA，PCR检测潮霉素B抗性标签以筛选阳性转基因烟株，代表性结果如图4所示。大部分T0代再生烟株均能扩增出约1 kb大小的特异性条带，与预期的PCR产物大小968 bp一致，说明这些烟株已被TALENs载体成功转化。最终，2个TALENs载体各获得约40和50株阳性转基因烟株。

2.4 T0代转基因K326烟株eIF4E-6基因突变检测

在eIF4E-6基因TALENs靶位点两侧序列设计引物（eIF4E6TALEN4&5-F2和eIF4E6TALEN4&5-R2），PCR特异扩增T0代阳性转基因K326烟株及非转基因K326烟草目标基因片段，代表性结果如图5所示。作为阴性对照的非转基因K326烟草扩增出单一的约200 bp大小的PCR产物，与预期PCR产物大小222 bp相符。后续对该产物测序结果表明，产物序列与eIF4E-6基因序列完全一致。这说明该对引物可用于eIF4E-6基因靶位点序列的测定。但是，绝大部分2个载体转化的T0代阳性转基因K326烟株得到的该基因片段的大小与阴性对照一致。这预示着，这些T0代转基因K326烟株的eIF4E-6基因在TALENs靶位点处可能未出现大片段的缺失或插入。

将扩增eIF4E-6基因靶位点序列的PCR产物连入T载体，进行克隆测序，并与非转基因K326烟草该片段序列比对，序列分析结果如图6所示。由图6A可知，T3转基因烟株T3-26 eIF4E-6基因由靶位点处开始出现49 bp的DNA片段缺失；单株T3-38、45、46则分别在TALENs载体Fok Ⅰ 核酸酶剪切位点出现单个碱基替换。由图6B可知，这些核酸序列的突变导致这些单株eIF4E-6基因翻译蛋白分别出现了蛋白翻译提前终止或单氨基酸残基的替换。由图6C、6D可知，T0代T4转基因烟株有5个单株T4-14、15、21、34、44在靶位点出现单碱基替换，导致靶位点处单氨基酸残基的替换。需要说明的是，这些突变均为杂合型突变，即每个单株克隆测序序列中仍有与野生型eIF4E-6基因完全一致的序列，而实际上一致的序列占多数。对部分T0代单株PCR产物直接测序的结果也验证了这一点，产物中占多数的未发生突变的eIF4E-6基因片段序列掩盖了占少数的突变序列。最终，这些eIF4E-6基因杂合突变的T0代转基因K326烟株为后续基因纯合突变后代的获得提供了材料。

3 结论与讨论

PVY病毒是危害烟叶生产的重要病害，长年对我国烟叶生产造成重大经济损失。PVY病毒是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的典型成员。近年发现，eIF4E蛋白是植物抗/感Potyvirus病毒的决定因子[2]。例如辣椒中抗PVY和烟草蚀纹病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）的pvr2基因[3]，拟南芥中抗芜菁黄叶病毒（Turnip Mosaic Virus，TuMV）和生菜花叶病毒（Lettuce Mosaic Virus，LMV）的lsp1基因[4，5]，生菜中抗LMV的mo1基因[6]等，不同植物物种中的所有这些Potyvirus病毒抗性相关基因都最终被鉴定为eIF4E基因家族成员。基于此，前期在普通栽培烟草中找到1个eIF4E-6基因，通过基因功能研究试验鉴定其为PVY感病基因。目前烟草抗PVY育种中采用的主要抗源是va基因[7]，它是1个控制烟草PVY抗性的单隐性抗病基因。在法国，有77.5%的烟草栽培品种含有此抗源[8]。2014年Julio等[9]确定普通烟草中的eIF4E基因家族中一成员（GenBank序列号KF155696），即对应va基因。经序列比对，该研究中的eIF4E-6基因與Julio等报道的KF155696序列完全一致。基于以上研究，通过目前的基因组编辑技术可以定向敲除普通烟草中PVY感病基因eIF4E-6，从而实现对烟草栽培品种的抗性改良。

近年来，基因组编辑技术的出现及迅速发展为实现作物的精准遗传改良提供了强大技术支撑。最初的基因组编辑工具锌指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases），因其在基因组作用靶点范围、基因编辑效率、组装技术难度、脱靶概率及突变遗传复杂性等方面的局限，而逐渐被后续出现的TALENs及CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-associated Protein 9）技术取代。TALENs技术近年来已成功应用于酵母、蛔虫、大鼠、斑马鱼、人胚胎干细胞等众多生物的靶向基因组编辑[10]，其中也包括水稻、拟南芥、烟草等多种植物物种[11]。该研究利用这一技术通过定向敲除烟草PVY感病基因来改良烟草的抗病性。由于该研究的目标基因eIF4E-6属于1个包含多达12个成员的基因家族，且成员间编码序列一致度高，所以最终仅选择2个靶点。依据靶点序列构建的TALENs载体在导入烟草前对其体外DNA剪切活性进行了检测，结果显示T4载体的活性高于T3。但最终T0代转化烟草的目标基因突变检测结果

表明T3

載体对目标基因的编辑效果要略优于T4。这说明，TALENs载体的体外活性可能并不能准确预测其在植物体内的基因组编辑效果。当然，由于该研究2个载体基因编辑效率较低，且获得的T0代烟株数量不足够大，这一结果需要更大数量后代材料的验证。从2个载体获得的T0代烟株目的基因的整体突变情况来看，突变均为杂合型且多数为单碱基替换，2个载体基因编辑效率偏低。这可能由于该研究所用的早期的（2013年）TALENs载体基因编辑效率不高[11]，也可能受到该研究目标基因与其他非靶标基因同源性的限制。

综上所述，该研究利用TALENs基因组编辑技术获得了eIF4E-6基因杂合突变型的T0代K326烟株，为将来获得纯合基因敲除的PVY抗性改良的烟草品种提供了材料。

参考文献

[1] 朱贤朝，王彦亭，王智发.中国烟草病害[M].北京：中国农业出版社，2002：209-216.

[2] ROBAGLIA C，CARANTA C.Translation initiation factors：A weak link in plant RNA virus infection[J].Trends in plant science，2006，11（1）：40-45.

[3] RUFFEL S，DUSSAULT M H，PALLOIX A，et al.A natural recessive resistance gene against potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E （eIF4E）[J].Plant journal，2002，32（6）：1067-1075.

[4] LELLIS A D，KASSCHAU K D，WHITHAM S A，et al.Loss-of-susceptibility mutants of Arabidopsis thaliana reveal an essential role for eIF （iso） 4E during potyvirus infection[J].Current biology，2002，12（12）：1046-1051.

[5] DUPRAT A，CARANTA C，REVERS F，et al.The Arabidopsis eukaryotic initiation factor （iso） 4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses[J].Plant journal，2002，32（6）：927-934.

[6] NICAISE V，GERMAN-RETANA S，SANJUAN R，et al.The eukaryotic translation initiation factor 4E controls lettuce susceptibility to the Potyvirus lettuce mosaic virus[J].Plant physiology，2003，132（3）：1272-1282.

[7] GUPTON C L，BURK L G.Location of the factor for resistance to potato virus Y in tobacco[J].Journal of heredity，1973，64（5）：289-290.

[8] LACROIX C，GLAIS L，VERRIER J L，et al.Effect of passage of a Potato virus Y isolate on a line of tobacco containing the recessive resistance gene va2 on the development of isolates capable of overcoming alleles 0 and 2[J].European journal of plant pathology，2011，130（2）：259-269.

[9] JULIO E，COTUCHEAU J，DECORPS C，et al.A eukaryotic translation initiation factor 4E （eIF4E） is responsible for the “va” tobacco recessive resistance to Potyviruses[J].Plant molecular biology reporter，2015，33（3）：609-623.

[10] GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F Ⅲ，et al.ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].Trends in biotechnology，2013，31（7）：397-405.

[11] ZHANG H，GOU F，ZHANG J S，et al.TALEN-mediated targeted mutagenesis produces a large variety of heritable mutations in rice[J].Plant biotechnology journal，2015，14（1）：186-194.