响应面优化葛根黄酮提取工艺研究

慕苗　高娟　高晶晶　白艳霞　高平强

摘 要：验以葛根粉为原料、乙醇为溶剂，研究了不同提取时间、不同提取温度、不同乙醇浓度对葛根黄酮提取率的影响，在单因素实验的基础上用紫外分光光度计法进行含量测定，并进行了3因素 3水平的 Box-Behnken设计优化了葛根黄酮的有关提取参数，最优工艺条件为：提取时间60min、提取温度80℃、乙醇浓度60%。在最佳优化条件下葛根黄酮提取率达到极大值，葛根黄酮提取率为36.64%。该方法快速简单，结果准确，可用于葛根素提取。

关 键 词：葛根黄酮；响应曲面；提取工艺

中图分类号：TQ 028 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2017）07-1299-04

Optimization of Pueraria Flavones Extraction Process

by Response Surface Method

MU Miao1，GAO Juan2， GAO Jing-jing1， BAI Yan-xia1，GAO Ping-qiang1

（1. Chemistry and Chemical Engineering Department， Yulin College， ShaanxiYulin719000， China

2. Yulin Institute for Drug Control， Shaanxi Yulin719000， China）

Abstract： Using puerarin powder as raw material and ethanol as solvent， effect of the extraction time， extraction temperature， ethanol concentration on the pueraria flavones extraction yield was studied by single factor experiment using method of ultraviolet spectrophotometer for content determination， and related parameters were optimized by 3-factor 3-level Behnken design. The best extraction conditions were obtained. The results show that the optimal technological conditions are as follows： the extraction time 60 min， the extraction temperature 80 ℃， the ethanol concentration 60%；Under above conditions，pueraria flavones extraction yield can reach to the maximal value， 34.87%. This method is quick and easy， accurate and can be used for extraction of pueraria flavones.

Key words： Pueraria flavones；The response surface；Extraction process

葛根黃酮是从豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一种黄酮苷，无毒无害。它富含抗自由基，抗氧化，适用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜动静脉阻塞、突发性耳聋，增强肌体的免疫力，改善微循环和抗血小板聚集的作用，对人类的肿瘤治疗和预防具有重要意义[1]。葛根属于天然野生植物资源，价格低廉，其提取物中有大量药用的有效成分，故在保健品应用研究开发中有较大的空间。因此，改进葛根黄酮提取工艺成为研究的热点[2-5]。

目前，文献报道的提取葛根黄酮的方法有很多，如水提取法、乙醇回流提取法、渗滤法、超声波法、微波萃取法、超临界萃取等[6-9]。大多数提取工艺采用正交设计试验。由于正交设计实验次数少，但分析不及响应面全面。响应曲面分析法能够准确求出各因素水平的响应值，并能分析两两因素之间的交互影响，预测最优理论值[10-14]。本文拟采用乙醇水浴回流提取中药葛根中的葛根黄酮，并用单因素Box-Behnken分析研究相关工艺条件，为葛根深加工和综合利用提供理论依据和技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器

紫外分光光度计（日本岛津公司），SHB-Ⅲ 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FA2004型分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）数显超级恒温水浴HH-501。

1.2 试药

葛根黄酮对照品，购于KAYOU公司（批号：20140704），纯度>98.0%。葛根粉，陕西省榆林市广济堂。无水乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠：均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 乙醇水浴回流提取

准确称取葛根粉1.0 g置于圆底烧瓶中，分别用不同提取时间15，30，60，120 min，不同提取温度40℃，50℃，60℃，70℃，80℃、不同乙醇浓度20%，30%，40%，50%，60%，水浴回流提取3次，抽滤，合并3次滤液，加入1mL 50 g·L-1 NaNO2溶液摇匀，静置；加入1mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液摇匀，静置；加入1mol·L-1NaOH溶液10mL，加去离子水定容至25mL容量瓶中待测。

2.2 提取率的计算

芦丁标准曲线的绘制：准确称取芦丁用乙醇定容制得质量浓度为100μg·mL-1的标准液。依次吸取2、4、6、8、10mL标准液分别用乙醇稀释至6mL定容至10mL，然后分别加入1mL 50 g·L-1 NaNO2溶液摇匀，放置6 min；加入1mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液，放置6 min；加入10mL 1mol·L-1的NaOH，加水定容到25mL，静置备用。在波长508nm处，依次测定各溶液的吸光度值，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线（图1），其线性关系y=0.1563+0.0784x，R2=0.9918，x为芦丁浓度，y为吸光度。

精密称取上述葛根黄酮粗提溶液1mL定容到25 mL容量瓶，按标准溶液测定方法，在508nm波长处测定吸光度计算浓度及葛根黄酮的提取率：

式中：c—测定样品溶液中的葛根黄酮的浓度；

v—样品溶液的最终体积；

m—样品质量。

2.3 单因素

用紫外分光光度计在250 nm波长下对样品中葛根黄酮进行单因素测定，测定不同时间，不同温度，不同乙醇体积分数对葛根黄酮含量的影响。

提取时间的影响：准确称取葛根粉1.0 g置于圆底烧瓶中，向烧瓶中加入浓度为60%的乙醇40 mL，水浴加热，温度为80 ℃，提取时间分别为15，30，60，120 min，提取3次，抽滤，合并3次滤液，加入1 mL 50 g·L-1 NaNO2溶液摇匀，静置；加入1 mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液摇匀，静置；加入1 mol·L-1 NaOH溶液10 mL，加去离子水定容至25 mL容量瓶中待测。

提取温度的影响：准确称取葛根粉1.0 g置于圆底烧瓶中，向烧瓶中加入浓度为60%的乙醇40 mL，加热温度分别为40，50，60，70，80 ℃，加热回流提取3次，提取时间分别为1 h，抽滤后合并3次滤液，加入1mL 50 g·L-1 NaNO2溶液摇匀，静置；加入1 mL100 g·L-1 Al（NO3）3溶液摇匀，静置；加入1 mol·L-1 NaOH溶液10 mL，加去水定容至25 mL容量瓶中待测。

乙醇体积分数的影响：准确称取葛根粉1.0 g置于圆底烧瓶中，向烧瓶中分别加入浓度为20，30，40， 50，60%的乙醇40 mL，加热回流提取3次，提取时间分别为1 h，抽滤后合并3次滤液，加入1 mL 50 g·L-1 NaNO2溶液摇匀，静置；加入1 mL100 g·L-1Al（NO3）3溶液摇匀，静置；加入1 mol·L-1NaOH溶液10 mL，加去离子水定容至25mL容量瓶中待测。

2.4 响应面试验设计

根据单因素優化结果：最佳提取时间为60 min，最佳乙醇浓度为60%，最佳提取温度为70℃。设提取时间，提取温度，乙醇体积分数为自变量，紫外吸光度为响应值，设计三因素三水平的试验，如表1。

3.1.1 提取时间的影响

从图2中可知，在20～60 min范围内，葛根黄酮提取液吸光度随时间增大而增大，提取时间大于60 min后，黄酮提取液吸光度有所下降。因此，实验选定提取时间为60 min。

3.1.2 提取温度的影响

从图3中可知，提取温度在40～70 ℃范围内，葛根黄酮提取液吸光度逐渐增大，提取温度高于70℃后，黄酮提取液吸光度开始下降。因此，实验选定提取温度为70 ℃。

3.1.3 乙醇浓度的影响

从图4中可知，乙醇体积分数在30%～60%范围内，葛根黄酮提取液吸光度逐渐增大，当乙醇体积分数大于60%后，黄酮提取液吸光度开始下降。因此，实验选定乙醇体积分数为60%。

综合图1、2、3得出：最佳提取时间为60 min，最佳乙醇浓度为60%，最佳提取温度为80 ℃。

3.2 响应面优化试验

3.2.1 Box-Behnken设计与结果

根据表1的因素和水平进行设计响应面试验，结果见表2。包括17个试验点，其中12个析因点、5个零点。

3.2.2 回归模型的建立与显著性分析

用Design Expert 8.0软件对表3中的数据进行分析其中A-时间，B-温度，C-乙醇体积分数，得出3因素与葛根黄酮浸出量之间的二次回归方程Y=0.91+0.010A+0.013B+0.010C-7.500E-004AB-7.500E-004AC+0.011BC-0.061A?-0.061B?-0.053C?。

由表3可知，R? =0.9890，AdjR? =0.9762一次项各因素中，提取时间（A），提取温度（B），乙醇体积分数（C）都为显著（P<0.05），二次项中的三个因素都极其显著（P<0.001），而交互项中只有提取温度（B）和乙醇体积分数（C）有极显著的影响，而提取时间（A）与提取温度（B），提取时间（A）与乙醇体积分数（C）显著性不太明显，显著性程度依次为：提取温度（B），提取时间（A），乙醇体积分数（C）。表明模型拟合度良好，P=0.0005﹤0.05，模型显著，失拟项（Lack of Fit ）=0.268>0.05，为不显著，说明响应面拟合回归方程具有显著意义，所以该模型可以预测葛根黄酮的提取。

3.2.3响应面分析

根据实验结果绘制出优化各因素的响应曲面。由图5（a）可以看出提取温度比提取时间对吸光度的影响显著，随着提取温度和提取时间的增加，吸光度在增加而后稍有下降，等高图5（b）接近椭圆形说明提取时间和提取温度对葛根黄酮吸光度的交互影响较显著。

由图6（c）可以看出提取时间比乙醇体积分数对吸光度的影响较明显，但提取时间过长对吸光度影响不大甚至略有降低，说明合适的提取时间对吸光度的影响很重要，由等高线图6（d）接近椭圆，说明提取时间和乙醇体积分数对吸光度的交互影响较显著。

由图7（e）可以看出，提取温度比乙醇体积分数对吸光度曲面陡峭，说明提取温度比乙醇体积分数对吸光度显著，由图7（f）等高线为椭圆，说明提取温度和乙醇体积分数对吸光度的交互影响相当明显。响应面优化结果显示：最佳提取时间为60 min，最佳乙醇浓度为60%，最佳提取温度为80 ℃。

3.2.4 平行验证实验

为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述最佳提取条件，提取时间为60 min，乙醇浓度为60%，提取温度为80 ℃。对葛根进行预处理经过3次平行验证实验，结果见表4，葛根黄酮的平均提取率可以达到35.27%，模型预测葛根素提取率为36.64%，与理论值相比，降低了3.73%，可见该模型较好的预测了实验结果，表明基于响应曲面法所得优化工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

4 总 结

本实验采用乙醇水浴回流提取法提取葛根中药材中的葛根黄酮，用紫外分光光度法检测其含量，以乙醇为溶剂，研究了不同提取时间、不同提取温度、不同乙醇浓度对葛根黄酮提取液吸光度的影响，先后采用单因素实验以及 Box-Behnken 设计优化了提取葛根黄酮的有关参数，推测其提取最优条件为：提取时间为60 min，乙醇浓度为60%，提取温度为80 ℃。这种方法简便快速，可用于葛根黄酮的提取。

参考文献：

[1]容林，杨旭东，陈理军，等. 葛根素药理作用及其作用机制研究新进展[J]. 广西大学农学院， 2014， 16 （178）： 138-140.

[2]李杏元， 陈国安. 微波辅助提取葛根黄酮工艺的优化[J]. 湖北农业科学， 2012， 51（16）： 3572-3574.

[3]王 辰，高 玲. 超声波辅助提取葛根黄酮的工艺研究[J]. 长江大学学报（自然科学版）， 2009， 6（4）： 61-66.

[4]李婷， 郑彩美， 张 彤，等. 均匀设计法优选葛根总黄酮提取工艺[J]. 时珍国医国药， 2010， 21（5）： 1088-1089.

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