高产纤维素酶菌株的筛选及其发酵条件的优化

赵健宇，刘靖

（湖南农业大学，湖南长沙410128）

高产纤维素酶菌株的筛选及其发酵条件的优化

赵健宇，刘靖*

（湖南农业大学，湖南长沙410128）

从陈年谷酒酒醪中提取一株高产纤维素酶的菌株，利用形态和16SrDNA基因序列进行分析，确定该菌株为甲醇芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）。利用产酶发酵培养基培养产生纤维素酶，研究碳源、氮源、培养基初始pH、起始温度、培养时间和接种量对菌株产酶的影响。结果表明，菌株最合适的发酵条件为：最佳碳源为CMC-Na，最适氮源为（NH4）2SO4，最适pH为5.0，最适发酵时间为5d，最适温度为30℃。从而筛选出高产纤维素霉菌株，优化了发酵条件。

纤维素酶；发酵因素；甄选；正交试验

纤维素是当前世界上最普遍应用的可重复再生的资源，随着社会的发展，不可再生资源（如石油、天然气等）的含量逐渐减少，利用纤维素转化成其他物质（如酒精、糖等）逐渐受到重视，同时也成为了当下研究的新领域。纤维素可通过酶类的作用生成葡萄糖，乙醇的生成可以利用纤维素霉的作用生产，具有广泛的发展远景，不仅可以用作汽车等机器的推进剂，而且降低了二氧化碳的生成，降低对不可再生资源（如石油、天然气等）的依赖性[1]。

纤维素转化为乙醇的2个过程的完成需要酶系催化。从未报道过有可直接催化纤维素的生物，同时该生物是具有较强能力的菌株，按分步糖化或同步糖化生产乙醇依旧是最佳方法[2]。所以，具有较强水平的纤维素霉菌株的选择，可以很好的提升纤维素转化乙醇的能力。此研究项目是土壤、酒醪、牲畜粪便中的高产纤维素霉菌株，使其发酵条件的提升。提升产酶效率，为利用纤维素酶在乙醇生产的应用上准备条件。

1 材料与方法

1.1 培养基配方

1.1.1 富集培养基

（NH4）2SO41.0g，Na2HPO4·7H2O 1.2g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，酵母膏0.5g，纤维素粉5.0g，加水至1 000mL，121℃，除菌25min[3]。

1.1.2 鉴别培养基

KH2PO41.0g，NaCl 2.5g，（NH4）2SO42.0g，MgSO40.5g，CMC-Na 2.0g，琼脂10.0g，加水至1 000mL，121℃，灭菌25min[4]。

1.2 菌株的筛选

从牛粪便、陈年谷酒酒醪和湖南农业大学附近土样中取样，经过不断的集中培养扩增纤维素分解细菌的含量。将集中培养的菌液在纤维素-刚果红培养基上培养至菌落长出，甄选透明圈/菌落直径比值大于5的菌落，在发酵培养基上接种，放在30℃厌氧培养器材下培养48h，再接种到滤纸培养基中，将所需菌株提取出。

1.3 酶活力的测定方法

1.3.1 内切纤维素酶（EG）的测定

取0.2mL粗酶液于试管中，加入0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.8）1.5mL，再加入2mL 2%的CMC-Na溶液，50℃水浴30min，按DNS法测定还原糖量，依葡萄糖标准曲线计算酶活。

1.3.2 外切纤维素酶（CBH）的检测

取0.000 02L的霉液放入玻璃容器中，后添入0.1mol/L pH为4.8的柠檬酸缓冲液1.5mL，再加入50mg脱脂棉，50℃水浴1h，按DNS法测定还原糖量，对照葡萄糖标准曲线计算酶活。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 菌株的形态鉴定

使用接种环选取少量菌体放在仪器上（载玻片），使用移液枪将PDA培养基滴到（1滴）接种的菌株上，确认添滴的培养基在菌株上分布均匀。将接种好的载玻片置于28℃的恒温箱培养48h，显微镜下观察并拍照。

1.4.2 分子鉴定

取1mL培养了12h的菌体，利用高速离心机取出细胞，添加0.5mLCTAB抽提液，在60℃下，30min后填入等量大小的氯仿/异戊醇（24/1）混合液，完全混匀，使用离心机，将上清液加入到新的离心管中，添加1mL异丙醇，通过离心机，将上清液去除，将去除上清液的离心管清洗2次（用70%乙醇），待自然风干后，添加30μL TE缓冲液，之后添加RNase，在37℃条件下保持30min。根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物（F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG：TACGGYTACCTTGTTACGACTT），扩增产物送上海集美生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

挑选透明圈/菌落直径比值较大菌株进行厌氧培养，各菌株生长情况见表1。

表1 菌株在厌氧环境下的生长情况

从上表可知，编号45、46、51、56、57、58、60、64、66、67的菌株为厌氧菌或兼性厌氧菌。将上述10株菌株分别接种到滤纸培养基中，发现56号菌株能在3d内将滤纸完全崩解，其余菌株要一个星期才能崩解，且崩解程度比不上56号菌株。因此选定56号菌株做进一步研究。

2.2 鉴定结果

显微镜下观察到菌丝如图1所示。

图1 菌丝显微镜观察图

从图1可见，显微镜下观察到菌丝有大量分枝，且多有横隔，孢子梗的分支呈现不规律排列，常伴有弯曲。分生孢子呈椭圆形，表面粗糙，直接着生在孢子梗上。

16S rDNA基因序列分析表明：56号菌株的16S rDNA基因序列与甲醇芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）的同源性达到了98%。初步可以确定56号菌株为甲醇芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

2.3.菌株产酶受碳源的影响

将不同碳源（麸皮、稻草粉、葡萄糖、淀粉和CMC-Na）以1%的量添加到50mL无碳基础培养基/250mL三角瓶中，温度保持在28℃，不调控pH值，取发酵液分别测定EG和CBH酶活，结果如图2所示。

图2 不同碳源对诱变菌株产酶的影响

图2结果表明，在以CMC-Na为唯一碳源的培养基中，EG和CBH酶活均最高；其次是以麸皮为碳源的培养基；对稻草粉的利用率最差。

2.4 菌株产酶受氮源的影响

将不同氮源（蛋白胨、黄豆粉、尿素、硫酸铵和硝酸铵）以1%的量添加到50mL无氮基础培养基/250mL三角瓶中，温度保持在28℃，不调控pH值，取发酵液分别测定EG和CBH酶活，结果如图3所示。

图3 不同氮源对诱变菌株产酶的影响

图3结果显示，较多氮源都可被该菌株利用，当（NH4）2SO4是氮源时，EG和CBH的酶活最高；而对NH4NO3的利用最差。

2.5 初始pH对菌株产酶的影响

在50mL产酶发酵培养基中，以1%的接种量将菌株接种到培养基里，分别调节pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，28℃下进行为期150r/min的培养，取发酵液分别测定CBH酶活和EG。图4表明，pH范围为4.0～6.0时，酶活力能维持在较高水平。其中，达到高峰水平的pH为4.0，pH值超过6.0时水平明显下降；pH值为10.0时基本上测不到酶活力。

图4 纤维素酶活力受初始pH的影响

2.6 初始温度对菌株产酶的影响

将菌株以1%的接种量接种到50mL产酶发酵培养基（250mL三角瓶中），分别于25～40℃（以3℃为一个梯度），在150r/min的条件下培养3d，分别监测发酵液的EG和CBH酶活。图5表明，28～31℃为该菌株的最佳产酶温度，28℃时EG酶活最高，31℃时CBH酶活最高。低温环境下不适用于该菌株的生长，高温环境下菌株被抑制生长，到温度最高时该菌株的菌丝体生长基本停止，酶活很低。

图5 初始温度对菌株产酶的影响

2.7 发酵时间对菌株产酶的影响

将菌株以1%的接种量接种到50mL产酶发酵培养基（250mL三角瓶中），在150r/min的条件下，分别培养1～7d，取发酵液分别监测EG和CBH酶活。图6表明，在培养前2d，菌株的EG和CBH酶活增幅较小，2～5d酶活增幅加快，EG酶活达到最高值是在第4天，第5天CBH酶活最高。5d后两种酶的活性快速下降，所以该菌株的最适培养阶段为4～5d。

图6 纤维素酶活力受培养时间的影响

3 结论

从陈年谷酒酒醪等选择物质中，得到70株左右具有较高水平的纤维素酶菌株，厌氧或兼性厌氧菌有10株。其中，出产纤维素酶能力最强的是56号菌株，通过生理生化分析和分子鉴定，可初步认为甲醇芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）。通过正交试验和单因素试验的检验，56号菌株具有最合适的发酵条件：最佳碳源为CMC-Na，最适氮源为（NH4）2SO4，最适pH为5.0，最适发酵时间为5d，最适温度为30℃。

[1]李素波.纤维素酶高产菌株的选育及发酵条件的优化[D].兰州:兰州大学,2008.

[2]孙多志,许庆利,王复,等.木质纤维素制取燃料乙醇水解工艺技术进展[J].河南化工,2008,25(4):1-4.

[3]文新亚,李燕松,张志鹏,等.酶解木质纤维素的预处理技术研究进展[J].酿酒科技,2006,23(8):97-100.

[4]于斌,齐鲁.木质纤维素生产燃料乙醇的研究现状[J].化工进展,2006,25(3):244-249.

Screening of High Yield Cellulase Strains and Optimization of Its Fermentation Conditions

Zhao Jian-yu,Liu Jing*
(Hunan Agricultural University,Hunan Changsha 410128)

A high yield cellulase strains was extracted from the old Valley wine mash filter,morphological and 16SrDNA gene sequences were used for analysis,the strain was identified as Bacillus methylotrophicus.Cellulase production was carried out by fermentation medium,and the effects of carbon source,nitrogen source,initial pH,initial temperature,incubation time and inoculation amount on the enzyme production were studied.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows: the optimum carbon source was CMC-Na,the optimum nitrogen source was (NH4)2SO4,the optimum pH was 5,the optimum fermentation time was five days,and the optimum temperature was 30 ℃.

Cellulase;Fermentation factors;Selection;Orthogonal test

TQ925

A

2096-0387（2017）03-0043-04

赵健宇（1992-），男，辽宁鞍山人，在读研究生，研究方向：环境生态学。

刘靖（1986-），男，湖南长沙人，硕士，讲师，研究方向：作物学。