HEPN1过表达慢病毒的构建及对人泌乳素型垂体瘤细胞的影响

2017-07-07冯杰夏祥国陈礼刚陈锐江勇张彪宋志富

东南大学学报（医学版） 2017年3期

关键词：垂体瘤孔板划痕

冯杰,夏祥国,陈礼刚，陈锐，江勇，张彪，宋志富

(西南医科大学附属医院神经外科，四川泸州 646000)

·论著·

HEPN1过表达慢病毒的构建及对人泌乳素型垂体瘤细胞的影响

冯杰,夏祥国,陈礼刚，陈锐，江勇，张彪，宋志富

(西南医科大学附属医院神经外科，四川泸州 646000)

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 HEPN1过表达慢病毒载体构建与包装

1.2.2 HPAs细胞培养和慢病毒感染

HPAs细胞用RM 1640加10%FBS、100 IU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。隔天更换培养液，细胞生长至85%融合时，0.25%胰蛋白酶消化、传代。慢病毒感染实验分为HEPN1组、空质粒组和空白组3组。取对数生长期的HPAs细胞接种于6孔板，感染6 h后弃去感染液，更换RM 1640加10%FBS的正常培养液继续培养。72 h后荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达，并收集各组细胞进行后续实验。

1.2.3.1 RNA提取稳定表达的HPAs细胞接种于6孔板，孵育48 h后收集各组细胞。Trizol法提取细胞总RNA。

1.2.4 蛋白质印迹法检测蛋白质表达

1.2.5 噻唑蓝比色法(MTT法)和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡

1.2.5.1 MTT法稳定表达的HPAs细胞接种于96孔板。分别于接种后的24、48、72、96、120 h，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg·μl-1)。继续孵育4 h后，小心吸掉培养基，每孔再加入二甲基亚砜150 μl，室温振摇15 min，酶标仪测定各组OD570 nm值并绘制曲线。

1.2.6 细胞侵袭和划痕实验检测细胞侵袭和迁移

1.2.6.1 细胞侵袭实验取稳定表达的HPAs细胞，使用无血清的RM 1640培养基将细胞接种于自带基质胶的小室上室，下室加入RM 1640加10%FBS。孵育48 h后，擦去靠近基底膜内室的细胞，另一面细胞经10%甲醇固定，磷酸盐缓冲液洗涤，结晶紫染色，磷酸盐缓冲液洗涤，显微镜下观察细胞并计数。

1.2.6.2 细胞划痕实验取稳定表达的HPAs细胞接种于6孔板，细胞生长至90%融合时，于6孔板底部沿直线划痕，并更换为无血清的RM 1640培养基。孵育48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，Gimesa染色，观察细胞迁移情况，细胞相对迁移能力=0 h划痕距离-48 h 划痕距离。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HEPN1过表达细胞的建立

感染72 h后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达，HEPN1组和空质粒组感染效率分别为90.3%和92.5%，空白组未见绿色荧光蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见图1。HEPN1组HEPN1的mRNA表达(1.27±0.33)高于空质粒组(0.25±0.08)和空白组(0.37±0.14)，差异具有统计学意义(F=34.559，P<0.05)；HEPN1蛋白表达(1.54±0.41)高于空质粒组(0.53±0.19)和空白组(0.49±0.15)，差异具有统计学意义(F=23.425，P<0.05)。详见图2。

图1 荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光蛋白表达

a 与空质粒组和空白组比较，P<0.05

2.4 MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡

细胞生长曲线显示，HEPN1组第12、24、36、48、72 h时的OD570 nm值显著低于空质粒组和空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示HEPN1组细胞的增殖能力明显降低，详见图5。双变量流式细胞仪散点图可见，HEPN1组细胞总凋亡率(31.28%)显著高于空质粒组(13.27%)和空白组(17.43%)，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见图6。

2.5 细胞侵袭和划痕实验检测细胞侵袭和迁移

细胞侵袭实验显示，HEPN1组穿膜细胞数目(21.27±8.41)个，显著少于空质粒组的(71.24±15.83)个和空白组的(66.72±14.46)个，差异具有统计学意义(F=21.602，P<0.05)，提示HEPN1组细胞侵袭能力显著下降，详见图7。细胞划痕实验显示，HEPN1组细胞迁移距离为(497.33±45.28)μm，较空质粒组的(858.25±74.16)μm和空白组的(893.27±68.53)μm差异有统计学意义(F=58.846，P<0.05)，提示HEPN1组细胞迁移能力显著下降，详见图8。

a 与空质粒组和空白组比较，P<0.05

图5 MTT法检测各组细胞增殖

3 讨论

国内外众多学者对垂体瘤作了大量研究，大部分学者认为原癌基因激活和抑癌基因失活是其形成的重要前提条件。抑癌基因HEPN1在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。Mei等[6]发现，HEPN1在原发性肝癌组织中的表达低于正常肝组织；过表达HEPN1可抑制肝癌细胞增殖，促进其凋亡。Hu等[7]研究证实：侵袭性垂体腺瘤组织中HEPN1表达低于非侵袭性组织；干扰HEPN1表达可促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡，并促进其侵袭能力。

Q1.中晚期凋亡细胞；Q2.坏死细胞；Q3.存活细胞；Q4.早期凋亡细胞

a 与空质粒组和空白组比较，P<0.05

图6 Annexin Ⅴ/PI双染色流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

为研究HEPN1在垂体瘤发生、发展中的作用，本研究利用慢病毒载体转染人泌乳素型垂体瘤细胞HPAs，观察过表达HEPN1对肿瘤细胞生物学行为的影响。本研究成功构建了HEPN1过表达慢病毒，并感染人HPAs细胞。结果显示，HEPN1组细胞HEPN1的表达显著高于空质粒组和空白组，提示已成功建立稳定过表达HEPN1的HPAs细胞。对细胞增殖和凋亡的检测发现，HEPN1组细胞的增殖受到明显抑制，细胞凋亡率显著增加。对细胞侵袭和迁移能力的检测发现，HEPN1组穿膜细胞数目和细胞迁移距离显著减少。以上实验结果提示，过表达HEPN1可以抑制细胞增殖，促进其凋亡，降低其侵袭和迁移能力。