维生素D对PDCD4表达的调控作用研究

2017-07-07饶泽兵张娜潘莹肖梦君吴俊仙陈允梓

东南大学学报（医学版） 2017年3期

关键词：培养皿炎症性调控

饶泽兵，张娜，潘莹，肖梦君，吴俊仙，陈允梓

(南京医科大学基础医学院，江苏南京 211166)

·论著·

维生素D对PDCD4表达的调控作用研究

饶泽兵，张娜，潘莹，肖梦君，吴俊仙，陈允梓

(南京医科大学基础医学院，江苏南京 211166)

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)分离和培养将处死的B57小鼠用75%酒精浸泡2～3 min，晾干酒精放在盘上，小鼠后肢的皮毛脱至足部，剪下后肢放在培养皿中，去除肌肉，用镊子提起股骨，在股骨大转子关节处剪下股骨，放入培养皿中，用1 ml注射器取生理盐水注入骨髓腔并冲洗2～3次，收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min。再用含10%L929细胞培养上清的DMEM培养基重悬细胞并分到培养皿诱导分化。将其放入37 ℃、含5%CO2的培养箱培养过夜，收集培养上清，离心，用含10% L929细胞上清的培养基重悬细胞再铺回培养皿，隔天换液，培养至第7天，贴壁细胞为小鼠骨髓来源的巨噬细胞。

1.2.5 统计学处理 SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素D抑制PDCD4的mRNA表达

在BMDMs中，采用不同终浓度(0、2、20、200 nmol·L-1)的维生素D进行刺激，24 h后收获细胞，用实时定量PCR方法检测PDCD4的mRNA表达。结果显示，PDCD4 mRNA水平随着维生素D刺激浓度的升高而下降，变化差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.001,n=3)(图1A)。再采用20 nmol·L-1维生素D刺激BMDMs，在不同时间点(0、8、16、24、32、48 h)检测，结果显示，PDCD4的mRNA表达水平与维生素D刺激时间呈负相关性，变化差异具有统计学意义(P<0.001,n=3)(图1B)。以上结果说明了PDCD4 mRNA水平受维生素D负调控，并表现为剂量依赖以及作用时间的负相关。

A.不同剂量维生素D刺激的BMDMs中PDCD4的mRNA水平；B.维生素刺激BMDMs,在不同时间点PDCD4的mRNA水平；aP<0.05，bP<0.01

图1 在原代BMDMs中，维生素D刺激对PDCD4 mRAN水平的影响

Fig 1 mRNA expression of PDCD4 with the stimuli of vitamin D in BMDMs

2.2 维生素D抑制PDCD4蛋白表达水平

为进一步确认维生素D对PDCD4的调控，我们采用免疫印迹法检测了PDCD4蛋白表达水平。实验结果如图2A，随着维生素D浓度(0、2、20、200 nmol·L-1)的增加，PDCD4蛋白表达水平呈下降趋势，表现为剂量依赖关系。同样，采用20 nmol·L-1维生素D刺激细胞不同时间(0、8、24、48、72 h)后，PDCD4的蛋白表达水平随着刺激时间延长而降低(图2B)，与检测的mRNA水平结果吻合。综上所述，维生素D能够抑制PDCD4的蛋白表达。

A.不同剂量的维生素D刺激的BMDMs中PDCD4蛋白水平；B.维生素刺激BMDMs,在不同时间点PDCD4的蛋白水平

图2 维生素D刺激的BMDMs中PDCD4的蛋白表达水平

Fig 2 Protein expression of PDCD4 with the stimuli of vitamin D in BMDMs

2.4 在LPS炎症模型中维生素D对PDCD4表达的调控

为了更好地阐明维生素D的抗炎作用，我们采用LPS诱导炎症细胞模型。当细胞在LPS诱导条件下，采用维生素D进行共刺激，然后检测PDCD4的蛋白水平。结果如图4所示，与LPS单独刺激相比，LPS与VD共刺激能更显著地抑制PDCD4的表达，说明炎症情况下，维生素D能有效地抑制PDCD4的表达水平。

3 讨论

图4 在LPS刺激的条件下，维生素D刺激的BMDMs中PDCD4的蛋白表达水平

Fig 4 Protein expression of PDCD4 with stimuli of LPS and vitamin D BMDMs

大量文献报道维生素D在炎症相关的疾病中发挥着重要的作用[1- 2]。维生素D作为一种激素，具有检测容易、易于补充和价格相对便宜等非常明显的特征和优势，因此研究其在炎症性疾病中的作用，将为预防、诊断和治疗炎症性疾病提供很大帮助。一系列的研究发现，在动脉粥样硬化[10]、心功能障碍[11]、糖尿病[12]等与炎症相关的疾病中，PDCD4发挥重要作用，是潜在的调控炎症性疾病的分子靶点。我们的研究表明，维生素D能够有效抑制PDCD4的表达，并且能够加强LPS对PDCD4的负调控，这将为深入了解维生素D在炎症性疾病中的作用机制提供有效帮助。