瘤背石磺表皮生长因子基因的克隆、结构及进化分析

杨铁柱, 沈和定, 史艳梅, 刘 欣, 吴 欣, 李 杰



瘤背石磺表皮生长因子基因的克隆、结构及进化分析

杨铁柱, 沈和定, 史艳梅, 刘 欣, 吴 欣, 李 杰

(上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306)

首次在瘤背石磺()中克隆得到一种新的表皮生长因子(EGF)的cDNA序列全长。EGF基因cDNA的全长为1158bp, 命名为1, 其中开放阅读框长度为846 bp, 编码一条包含281个氨基酸残基的多肽链。根据氨基酸序列比对和结构域分析结果发现其含有2个保守的EGF结构域和1个EGF-like结构域, 每个结构域中均包含至少6个半胱氨酸残基, 且形成CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C结构, 其结构域由C1~C3、C2~C4和C5~C6之间形成的3个二硫键维持, 符合表皮生长因子家族及其相关蛋白的特征结构域, 但其余氨基酸序列与现有相关基因差异较大, 推测可能是一种新的EGF-like基因。利用MEGA6.0软件构建1与EGF家族相关蛋白的系统进化树, 表明EGF家族蛋白具有一定的物种特异性。

瘤背石磺(); EGF; 基因克隆; 系统进化分析

瘤背石磺()隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、肺螺亚纲(Pulmonata)、缩眼目(Systellommatophora)、石磺科(Onchidiidae), 是一种具有很高的食用和药用价值的贝类[1-3]。其分布区域常见于我国的江苏、上海、浙江、福建、广东等地的淡水和咸水交汇处的高潮带, 其温度适应性强, 分布范围广, 资源量非常丰富。目前国内外学者对石磺的研究主要集中在系统分类[4-5]、生物学特征、胚胎发育、营养价值、受精和繁殖机制以及活性物质的分离提取等方面[6-8], 未涉及功能基因组的范畴, 本文对于瘤背石磺功能基因的结构和进化进行了较为深入的分析, 希望能为瘤背石磺的功能基因研究积累资料。

EGF(Epidermal growth factor)是由Cohen[9]博士在1962年一次实验中偶然发现的, 也是最早发现并确立结构的生长因子。随后的研究表明, EGF广泛存在于人类及其他动物体内, 从低等到高等、单细胞到多细胞、海洋到陆地均能发现其存在。EGF并不是单一的生长因子, 而是一个有众多生长因子所组成的大家族, 它包括转化生长因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)、肝素结合性表皮生长因子(heparin binding EGF, HB-EGF)、双调蛋白(amphiregulin, AR)、细胞素(betacellulin, BTC)、神经调节素(neuregulin, NGR)与表皮素(epiregulin, EPR)等[10]。这些因子中都包含至少1个由3对二硫键所维持具有高度保守性的EGF-like结构域[11]。在生物学过程中, EGF需要与EGF受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)相结合, 形成同源或异源二聚体, 以引发诸如ras-raf-MEK-erk/MAPK和P13K-PKC-IKK等下游信号通路, 介导细胞间的信号传导, 促进细胞内部相应DNA、RNA和蛋白质的合成分泌, 从而诱导细胞进行增殖、迁移和分化等生物学过程[12-13]。

目前对于EGF的研究主要集中在人类等高等脊椎动物上, 例如EGF在肿瘤细胞中的表达水平变化情况[14]、在中枢神经系统中的重要性[15]以及对烧伤创面修复的临床应用[16]等, 然而在无脊椎动物, 尤其是海洋生物中涉及甚少。朱文杰等[17]从合浦珠母贝()中克隆得到EGF同源基因1, 并发现在肠道修复和幼虫表态发育阶段起着重要作用。Hermann等[18]从静水椎实螺()中克隆得到EGF同源基因, 发现其在生长及损伤修复过程中发挥重要作用。以及Hursh[19]和Bisgrove[20]在紫球海胆()、Woods[21]和Eri[22]从海鞘()中均克隆出EGF家族相关基因。

本实验采用瘤背石磺作为研究对象, 主要是由于其作为栖息于滩涂半咸水区域的两栖性生物方便采集。另外, 在采集后的暂养工作在本实验室已趋于成熟。而在摄食和运动过程中, 瘤背石磺直接与外界接触的表皮有大量损耗, 也相应刺激表皮生长因子的表达。故在本实验中选取瘤背石磺作为研究客体。

作者首次从瘤背石磺的背部表皮中克隆并鉴定出一个EGF-like基因, 并从结构和进化两方面进行深入分析, 发现EGF-like基因具有一定的物种特异性, 为进一步研究1基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

实验所用的瘤背石磺采自上海市东海大桥沿岸的芦苇荡, 并放置于实验室暂养箱中暂养, 定时向箱内投放玉米粉、添加清水、清理排泄物, 及时清除掉死亡个体。实验前选取健康活力强、体长50 mm左右的个体, 并用清水洗净其身体表面的附着物。

实验所用的RNA提取试剂盒、2*Taq PCR Mix、DH5-α感受态细胞购自天根(北京)生化科技有限公司; LA-Taq酶、反转录试剂盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser)、RACE试剂盒(含5′和3′)购自TAKARA公司; 琼脂糖、LB培养基、DNA片段纯化试剂盒、三氯甲烷、异丙醇等购自生工生物工程(上海)有限公司; pGEM-easy vector购自Promega公司; 核酸电泳缓冲液购自莱峰生物公司。实验中所用到的引物合成及序列测定工作均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 RNA提取与cDNA合成

取瘤背石磺的背部皮肤, 按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA, 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性并使用超微量分光光度计(Nano Drop ND-2000/2000C, Thermo Fisher Scientific, USA)测其核酸浓度和260/280后置于超低温冰箱中保存备用[23]。利用RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA第一链; 利用TaKaRa 3′Full RACE Kit合成3RACE-cDNA, 用5′Full RACE Kit合成5RACE-cDNA,于–20℃保存备用。

1.3 EGF-like的基因克隆

根据瘤背石磺转录组序列中得到的EGF-like基因片段, 利用Primer 5.0软件设计出引物F1、R1扩增目的片段(表1)。利用引物已知的Tm值, 设计温度梯度实验, 确定最适退火温度61.7℃。50 μL PCR反应体系为2*Taq PCR Mix 25 μL, ddH2O 20 μL, 上下游引物(F/R)(10μmol/L)各1.5 μL, cDNA 2 μL。PCR反应条件为94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 61.7℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 循环35次; 72℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳后使用DNA胶回收试剂盒纯化目的片段, 并将目的片段连接到pGEM-easy vector载体上, 转化进入到大肠杆菌感受态细胞.DH5-α, 在LB/AMP固体平板上37℃培养, 经蓝白斑筛选和菌液PCR检测后将阳性克隆送生工测序, 并将所得序列结果与已知序列进行比对。

表1 实验中所用到的引物序列

Tab.1 Sequences of primers used in this study

根据测序得到的目的片段, 分别设计5′和3′RACE特异性引物(表1), 以3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA为模板, 按照TAKARA RACE说明书中步骤分别进行3′RACE和5′RACE反应, 所得PCR产物经琼脂糖电泳、割胶回收、连接转化后, 通过蓝白斑筛选和菌液PCR检测后将阳性克隆送生工测序。使用DNAMAN6.0软件将3次测序结果进行拼接, 获得基因的cDNA全长序列。

1.4 序列特征和结果分析

使用NCBI中ORF Finder(http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)查找基因的开放阅读框(ORF); 使用BioEdit和DNAstar软件预测氨基酸序列; 使用ProtParam(Http: //web.expasy.org/protparam/)来预测所编码蛋白的理化性质; 使用SignalP4.1(http: //www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)来预测蛋白质的信号肽序列; 使用TMHMM services 2.0(http: //www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)来预测蛋白质的跨膜结构域; 使用NetPhos2.0 Serber(http: //www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)来预测蛋白质的磷酸化位点; 使用Subloc v1.0(http: //www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)对蛋白质进行亚细胞定位; 使用SMART(http: //smart. embl-heidelberg.de/)分析蛋白质的功能结构域; 使用Mega6.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 EGF-like基因的基因克隆

通过对瘤背石磺转录组数据的综合分析比对, 发现转录组数据中的S_Unigene427_c2_seq6基因被描述为epidermal growth factor-like, 且与NCBI数据库比对后发现其与multiple epidermal growth factor-like domains protein 10 ()相识度最为接近。

根据该核苷酸序列在其保守区设计验证引物, 获得802 bp的PCR扩增产物。用BioEdit进行双序列比对结果显示, 该片段与待验证核苷酸序列中被扩引物之间的序列99%的一致, 覆盖度达到67.57%, 一方面证明该序列的正确性, 可以应用于cDNA全长的克隆; 另一方面也发现原预测的核苷酸序列存在一定的缺失, 或是基因测序拼接的不完整性造成的[24]。

3′RACE扩增得到一条569 bp的片段, 包含加尾信号(AACAAA)和poly(A)尾巴。5′RACE扩增得到一条301bp的片段。将上述序列片段进行拼接后, 得到一条全长为1158bp的cDNA序列(GenBank登录号: KU556757), 通过blastx比对分析, 确定该基因属于EGF大家族。其中开放阅读框长846 bp, 编码一条长为281个氨基酸残基的多肽链, 终止密码子为TGA, 加尾信号位于1129~1134, 后面紧跟着poly(A)尾巴。5′UTR长度为166 bp, 3′UTR长度为130 bp(图3)。

2.2 EGF-like基因的cDNA序列分析

通过RACE克隆技术获得的瘤背石磺表皮生长因子(EGF-like)基因命名为1。ProtParam软件预测其分子量为30.51 ku, 理论等电点(PI)是5.41。SignalP4.1信号肽预测1没有信号肽序列, 跨膜结构预测软件TMHMM services 2.0显示该基因存在一个跨膜结构域(膜内1~16aa, 膜上17~39aa, 膜外40~281aa)。磷酸化位点预测软件NetPhos2.0 Serber显示1基因含有6个Ser、3个Thr、3个Tyr, 可能为蛋白激酶磷酸化位点。细胞定位预测表明1基因定位在细胞外, 是分泌性蛋白的可能性较大。功能结构域预测软件SMART显示1基因含有2个EGF结构域(46~77aa、139~170aa)和一个EGF-like结构域(92~137aa), 每个EGF结构域均包含6个半胱氨酸残基, 结构域内部各自形成3个二硫键, EGF-like结构域包含8个半胱氨酸残基。使用SWISSmodel软件对1氨基酸序列进行三维结构预测, 结果如图1。

将1的氨基酸序列在NCBI中Blast同源性比对得知, 与其匹配度最高的是腹足纲生物中的multiple epidermal growth factor-like domains protein 10蛋白序列(XP_013086610.1),匹配度达到51%。相似度较低一点的是, 同样是multiple epidermal growth factor-like domains protein 10的蛋白序列(XP_011433900.1), 同源性为43%。将两者的氨基酸序列同1进行多重序列比对后, 结果如图2所示。

瘤背石磺1基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列如图3所示。

使用BioEdit软件将瘤背石磺1基因的3个EGF-like结构域同EGF家族及其相关蛋白的EGF-like结构域做比较, 结果表明1与EGF家族及相关蛋白的6个半胱氨酸残基是高度保守的, 且均符合CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C结构, 如图4。

使用Mega6.0软件, 对瘤背石磺1及EGF家族其他成员的氨基酸序列进行比对并构建系统进化树图5。结果表明, 大体上EGF家族每个成员的不同物种基因相应的聚为群组。的TGF-α蛋白单独聚为一支, 小家鼠()和人类()的相关蛋白聚为一支,1单独聚为一支, 剩余4种的EGF相关蛋白形成两分支又聚为一支。

图中蓝色字体为起始密码子和终止密码子, 黑色加粗字体为加尾信号; 阴影部分是保守的EGF-like结构域, 红色字体为6个典型的半胱氨酸残基

Blue indicates the initiation codon and stop codon; bold black indicates polyadenylation signals; shadow indicates the conserved EGF-like domain; red indicates six typical cysteine residues

3 讨论

表皮生长因子(EGF)家族的研究报道在脊椎动物中比较丰富。本文利用瘤背石磺转录组, 首次在该物种中克隆得到EGF-like基因1, 通过功能结构域分析发现其包含1个跨膜结构域(17~39aa)、2个EGF结构域(46~77aa、139~170aa)和一个EGF-like结构域(92~137aa), 将其与家族中其他成员及其相关蛋白的结构域比较, 发现1和他们有着相同的EGF-like结构特征, 包含典型的6个半胱氨酸残基, 且符合CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C结构, 其中完全保守的6个半胱氨酸残基C1~C3、C2~C4和C5~C6之间形成的3个二硫键, 使得这些多肽链能够形成相似的空间结构, 因而可以与EGF受体结合介导细胞间的信号传递。

字体C表示6个保守的半胱氨酸残基

C indicates six conserved cysteine residues

EGF家族蛋白在高等哺乳类动物中已能够广泛获取, 同时, 在海洋软体动物、两栖类生物甚至病毒细菌中均发现有EGF-like结构域, 可说明在物种的进化过程中EGF-like结构域是相对保守的。目前在贝类中研究报道的EGF家族及其相关蛋白基因有16种之多, 例如太平洋牡蛎()的EGF-like基因[25]、光滑双脐螺()的EGF想关基因[26]、新西兰青蚝()的EGF相关基因[27]、九孔鲍()的HdEGF1基因[28]、紫贻贝()的EGF相关基因[29]、菲律宾蛤仔()的EGF_CA相关基因[30]、合浦珠母贝的1基因。将1和上述基因的序列比对, 结果表明除了EGF-like结构域之外(图4), 其余氨基酸序列并没有表现出相似性。而根据在NCBI上BLAST结果及多重序列比对显示,1同其他物种的EGF-like基因同源性并不高, 最高仅为51%, 这也符合海洋生物之间基因差异较大的规律。以此推测1基因是EGF家族及其相关蛋白基因的新成员。

EGF家族蛋白在人类高等生物中的分布和表达十分丰富, 而且对其的研究也比较深入。S Kumar发现, 长期吸烟的人群会诱导EGF家族的肝素结和性表皮生长因子HB-EGF在巨噬细胞中过量表达, 使人患胰腺癌的几率变大数倍[31]。Hoda I发现通过药物降低EGF和EGFR基因的表达量可以显著抑制艾氏腹水瘤生长[32]。另外, Ito J的研究发现呼吸道上皮损伤可以通过HBEGF和TGF-α来诱导TGF-β1和TGF-β2的表达量增加来达到修复效果, 这同EGF家族细胞成员细胞素(BTC)在人体中的肠道等表皮易损伤的部位表达量较高时想吻合的[33-34]。

本研究首次在瘤背石磺中克隆得到表皮生长因子类似(EGF-like)基因1的cDNA全长序列, 并对其从结构和进化两方面进行了生物学信息分析, 分析结果表明1可能是一个新的EGF-like基因。本研究为进一步研究1的功能奠定基础。

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(本文编辑: 梁德海)

Molecular cloning and characterization of EGF-like gene in

YANG Tie-zhu, SHEN He-ding, SHI Yan-mei, LIU Xin, WU Xin, LI Jie

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The complete cDNA sequence of the EGF-like gene was cloned fromfor the first time. cDNA of the EGF-like gene was named1; it consisted of 1158 bp containing a 846-bp ORF that encoded a peptide of 281 amino acids. Multiple alignment and conserved domain analysis indicated that this peptide chain contained two conserved EGF domains and one EGF-like domain. Each domain contained at least six cysteine residues (CX7 CX4–5 CX10–13 CXCX8 C) that can form three disulfide bonds between C1 and C3, C2 and C4, and C5 and C6. These characteristics are consistent with the EGF protein family. However, the remaining sequences of1 were considerably different from other members of the EGF family. Thus, we proposed that1 is a novel EGF-like gene. A phylogenetic tree was built using MEGA6.0 to investigate the relationship between1 and proteins belonging to the EGF family. The study also suggested that proteins belonging to the EGF family are species-specific.

; EGF; gene cloning; phylogenetic analysis

Jun. 19, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No. 41276157; Shanghai Fisheries College discipline construction project]

S917.4

A

1000-3096(2017)03-0008-09

10.11759/hykx 20160121002

2016-06-19;

2016-11-18

国家自然科学基金资助项目(41276157); 上海高校水产学一流学科建设项目

杨铁柱(1990-), 男, 河南周口人, 硕士研究生, 主要从事海洋贝类功能基因研究, E-mail: yangtiezhu1234@163.com; 沈和定, 通信作者, 教授, 电话: 021-61900446, E-mail: hdshen@shou.edu.cn