斑节对虾4个地理群体遗传多样性的AFLP分析

孙苗苗, 杨其彬, 陈百尧, 朱彩艳, 黄建华, 江世贵, 周发林



斑节对虾4个地理群体遗传多样性的AFLP分析

孙苗苗1, 2, 杨其彬1, 陈百尧2, 朱彩艳1, 黄建华1, 江世贵1, 周发林1

(1. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 510300; 2. 连云港市海洋与水产科学研究所, 江苏连云港 222044)

为研究斑节对虾()4个地理群体的遗传背景, 作者应用AFLP分子标记技术对非洲(F)、中国三亚(S)、泰国(T)和印度尼西亚(Y)的斑节对虾群体进行遗传多样性分析。选取8对引物组合对斑节对虾4个群体共128个个体进行分析比较, 共获得1 000个位点, 其中多态性位点数为830个, 各群体多态位点比率为47.8 %~58.5 %; 群体Nei’s遗传多样性指数为0.0917~0.1271, Shannon’s 信息指数为0.1484~0.2032。4个群体间的遗传距离, Y与F之间最大, 为0.331, T与S之间最小, 为0.217。4个群体UPGMA聚类时, S、T与Y聚为一支, F为单独一支; 128个个体的UPGMA聚类结果表明, F群体除4个个体外其余个体聚为一大支, S、T、Y群体的部分个体互相混杂。AMOVA分析发现, 35.92%的变异来自于群体间, 64.08% 的变异来自于群体内, 群体间的遗传分化系数为0.3592, 表明4个群体间的遗传分化程度很大。本研究为斑节对虾遗传育种提供了种质遗传背景资料, 并为斑节对虾资源的开发与利用提供基础数据。

斑节对虾; 遗传多样性; AFLP; 地理群体

斑节对虾(是个体最大的对虾种, 广泛分布于印度洋和西太平洋的大部分海区, 是世界上最主要的养殖对虾之一, 也是中国南方沿海诸省的重要养殖对象。有关其分子水平研究, 国内外一些学者也做了相关的研究, 如谭树华等[1]运用同工酶和RAPD 技术对不同斑节对虾养殖群体的遗传多样性进行了研究。姜永杰等[2]对深圳海域斑节对虾野生种群线粒体控制区序列的多态性进行了探讨。周发林等[3]对海南三亚斑节对虾野生种群mtDNA 16S rRNA 基因和控制区序列的多态性进行了研究。Tassanakajon等[4]运用RAPD 技术分析了野生种群的基因多样性水平。Pan等[5]筛选了23 对多态性较高的微卫星标记用于斑节对虾的遗传多样性和种群结构的分析。Xu等[6]运用微卫星标记技术研究了菲律宾野生和养殖的斑节对虾群体的遗传多样性水平。而利用AFLP分析斑节对虾遗传多样性研究未见报道。

AFLP是迄今最有效的分子标记之一, 在水生生物中已被广泛应用于遗传多样性分析[7-10]、系统进化和亲缘关系的鉴定[11-12]、基因定位克隆[13]、遗传图谱构建[14]等诸多领域。本研究采用AFLP技术对斑节对虾4个不同地理来源的亲本进行遗传分析, 以了解其遗传多样性、种群遗传结构和遗传特征等信息, 为斑节对虾的遗传育种积累材料和提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

4个地理群体斑节对虾分别从印度尼西亚、泰国、非洲和中国三亚4个地区引进。体长116.10~ 255.00 mm, 体质量122.6~294.8 g。取眼柄或腹足保存于95%的酒精中, 用于DNA的抽提。样品的详细信息见表1。

1.2 基因组DNA提取

斑节对虾基因组DNA提取参照熊小飞[15]的方法提取的DNA用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测, 并制成终质量浓度为50 ng/μL的模板DNA备用。

表1 实验所用的样品信息

1.3 AFLP分析

用于AFLP分析的内切酶为R I和I, 均为NEB公司生产; 实验所用的接头和引物由英骏公司合成, 序列见表2; T4 DNA 连接酶由Takara公司生产。反应步骤和反应体系如下:

(1)R I酶切反应: DNA (20 ng/µL) 5 µL,R I (10 U/µL) 0.5 uL 10×R I Buffer 1 µL, ddH2O补齐至10 µL, 37℃酶切1 h。

(2)I酶切反应:R I酶切反应液10 µL,I (10 U/uL) 0.2 µL, 10×I Buffer 0.1 µL, 37℃酶切2.5 h。

(3) 接头连接反应: 双酶切产物10 µL, 10×T4 DNA连接酶Buffer 2 µL, E接头(2.5 µmol/L)1 µL, M接头(12.5 µmol/L)2 µL, T4连接酶(6 U/µL)0.2 µL, ddH2O补齐至20 µL, 37℃反应1 h, 16℃连接20 h。

(4) 预扩增: 10×PCR Buffer (Mg2+) 2.5 µL,R I +1引物(50 ng/µL)1 µL,I +1引物(50 ng/µL)1 µL, dNTPs (2 mmol/L) 3 µL, rTap酶(5 U/µL)0.3 µL, 模板DNA的连接产物4µL, ddH2O补齐至25µL。反应程序: 94℃变性3 min后, 进行24个循环(94℃ 30 s, 56℃30 s, 72℃ 30 s), 最后72℃延伸10 min。

(5) 选择扩增: 10×PCR Buffer (Mg2+)2.1 µL,R I +3引物(100 ng/µL)2 µL,I +3引物(100 ng/µL) 2 µL, dNTPs (2 Mm/each)1.5 µL, rTap酶(5 U/µL)0.1 µL,预扩增产物5 µL, ddH2O补齐至25 µL。反应程序: 94℃变性3 min, 进入9个循环(94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s), 然后进行24个循环(94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s), 最后72℃延伸10 min。

(6) 取10 uL产物, 采用ABI 3730 DNA分析仪进行分析。

1.4 数据分析

根据所获得的AFLP峰值, 将分子量大小一致的峰值看作1个位点, 在各位点上, 针对不同个体若存在清晰可辨的扩增峰则标记为1, 否则标记为0, 由此构建0-1矩阵。统计多样性位点比率, 并采用POPGENE3.2[16]计算该种群内部观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数以及Shannon’s 多样性信息指数, 分析种群内和种群间的遗传距离。然后根据遗传距离表, 采用MEGA软件构建遗传距离聚类图, 对4个群体的数据用Arlequin软件进行AMOVA分析。

2 结果

2.1 AFLP扩增多态性

采用8对AFLP 引物对4个群体共128个个体进行DNA 扩增。共得到1 000个AFLP 位点。每对引物扩增位点在111~130个, 平均每对引物扩增出125个AFLP 位点。扩增位点最多的引物对是E2M2和E5M5, 扩增位点数均为130。每对引物扩增的多态位点均较高(>75%)。其中, E2M2引物对产生的位点多态比例最高, 为95.38%。8对引物在4个群体中共产生了群体特异性位点245个, 其中, F群体中出现的特异性位点70个、S群体62个、T群体50个, Y群体63个(表3)。

2.2 各群体遗传结构和遗传多样性分析

由表4 可知, 8 个引物对在非洲、中国三亚、泰国、印尼4个斑节对虾群体中检测出多态位点数及比例分别为: 478个(47. 8%)、525个(52.5%)、585个(58.5%)、530个(53.0%), 其中非洲群体的多态位点数最低。F群体的Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s指数最小, 分别为0.0917、0.1484。

2.3 群体间遗传相似度和遗传距离

群体间遗传相似度和遗传距离见表5。F与S、T和Y之间的遗传距离均较远, 分别为0.299、0.330和0.331; S、T与Y之间遗传距离均较近。

表2 用于AFLP分析的接头和引物序列

表3 8对AFLP引物组合的扩增结果

表4 斑节对虾4个群体的遗传多样性参数

表5 群体间相似度和遗传距离

注: 对角线上为遗传相似度; 对角线下为遗传距离

2.4 4个群体间的遗传分化

AMOVA 分析表明, 35.92%的变异来自于群体间, 64.08% 变异来自于群体内, 群体间的遗传分化系数(F)为0.3592, 遗传分化值小于0.01, 表明3个群体间的遗传分化程度很大, 达到了显著性水平(表6)。4个群体之间的遗传分化指数在0.103 48~0.502 32, 遗传分化顺序为F-S >F-Y>F- T>S-Y> S-T>T-Y(表7)。

表6 4个群体间的AMOVA分析

表7 3个群体间的遗传分化系数和基因流

注: 对角线下为遗传分化系数(F), 对角线上为基因流(N)

2.5 聚类分析

基于Nei遗传距离构建UPGMA系统发生树。聚类分析表明, 4个斑节对虾群体聚成两支, 其中F群体独立聚为一支, S、T、Y 这3个群体聚为另一支(图1)。4个群体128个个体的UPGMA聚类结果表明, F群体除4个个体外, 其余个体均聚在一起, 具有独立的遗传结构; 而S、T、Y 3个群体较F群体混杂的情况更严重一些, 说明这3个群体间存在较大的交流(图2)。

3 讨论

遗传多样性是生物对复杂环境适应能力的一种反应, 对该生物的可持续发展、合理开发利用有着重要的意义[17]。遗传多样性是评价生物资源状况的重要依据, 是物种适应环境变化、维持生存与进化的遗传基础。平均多态位点比例和平均杂合度是衡量生物群体遗传多样性高低的重要参数[18]。在AFLP分析中, 多态位点比率既与研究的样本来源及其数量有关, 也与各个引物的扩增效率有关。黄羽等[19]采用AFLP技术分析了6个克氏原螯虾()群体遗传多样性, 结果发现多态位点百分比为39.53%~75.74%。颉晓勇等[20]利用AFLP方法, 依靠6对引物对6个群体180尾凡纳滨对虾()进行分析, 结果显示各群体的多态位点比率在68.39%~71.20%。在本研究中, 斑节对虾4个地理群体多态位点百分比为47.80%~58.50%, 因此可以认为这4个群体斑节对虾具有较高的遗传多样性。非洲群体亲本较其他3个群体遗传多样性较低, 多态位点百分比为47.80%, Nei’s遗传多样性指数(0.091 7)和Shannon’s信息指数(0.148 4)均低于其他3个群体。

标尺为遗传距离(图2同)

Bar: genetic distance (the same as Fig.2)

Thorp[21]研究认为, 不同物种间的遗传相似系数为0.2~0.8, 同科属群体间为0.5~0.9, 同种群体间为0.8~0.97。遗传分化系数是衡量群体再分效应的指标, 反映因遗传漂变引起物种杂合度的降低程度。遗传分化系数在 0.00~0.05, 表明群体分化程度较小; 0.05~0.15, 说明群体分化程度中等; 0.15~0.25, 表明群体分化程度较大; 0.25~1.00则表明群体分化程度很大[22]。当种群基因流大于1 时, 种群间存在一定的基因流动, 如果种群基因流远远小于1, 种群则会出现强烈的分化[23]。在本研究中, 非洲群体与中国三亚、泰国、印度尼西亚群体的遗传距离相对较大, 遗传相似度较小(表5)。本研究结果显示(表7), 非洲群体与其他3个群体间的遗传分化系数为0.43575~ 0.50232, 基因流为0.49538~0.64745, 远小于1, 说明非洲群体与中国三亚、泰国、印度尼西亚群体分化程度很大。而中国三亚、泰国、印度尼西亚群体间存在一定的基因交流, 遗传分化较小。中国三亚、泰国群体位于西太平洋, 印度尼西亚群体来自东印度洋, 尽管不在一个大洋内, 但从地理位置上讲印度尼西亚群体与中国三亚、泰国群体相隔较近, 中间虽有岛屿海峡隔离, 但还是存在一定程度的基因交流。而非洲群体则位于西印度洋, 与其他3个群体相隔较远, 群体间的交流受到制约。4个群体聚类分析显示, S、T、Y 3个群体聚为一支, F群体独立为一支; 4个群体的128个个体聚类显示, S、T、Y 3个群体个体间混杂程度较高, 进一步验证了上述结论。Duda等[24]研究证实西太平洋内部各地理群体斑节对虾之间基因交流频繁, 而印度洋内部各群体之间的交流则受到一定程度的制约。其结论与作者的结论基本一致。

通过AFLP遗传多样性分析, 尽管非洲群体遗传多样性略低于其他群体, 但与其他群体间的遗传分化较大。因此, 大致可以将4个群体分为2个种质类型, 三亚、泰国和印度尼西亚群体可以看作是同一个种质类型, 而非洲群体则为一个单独的种质类型。现代杂交优势理论认为, 亲本间遗传差异的大小影响了其后代杂交优势的水平, 遗传距离愈大所产生的杂交优势则愈大[25]。作者认为, 在斑节对虾杂交选育工作中, 将遗传分化较大的非洲群体与其他群体进行杂交可能会取得更好的杂交效果。

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(本文编辑: 谭雪静)

Genetic diversity in four populations ofassessed by AFLP makers

SUN Miao-miao1, 2, YANG Qi-bin1, CHEN Bai-yao2, ZHU Cai-yan1, HUANG Jian-hua1, JIANG Shi-gui1, ZHOU Fa-lin1

(1. Key Lab of South China Sea Fishery Resources Exploitation ＆ Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. Lianyungang Marine and Fishery Sciences Research Institution, Lianyungang 222044, China)

The genetic diversity of fourpopulations (Africa population, F; Sanya population, S; Thailand population, T; Indonesia population, Y) was analyzed by the AFLP technique. One thousand bands were detected with eight primer combinations. The polymorphic bands of four populations and the ratio of polymorphic loci were 478–585 and 47.8%–58.5%, respectively. Nei’s gene diversity index and Shannon’s information index were 0.0917–0.1271 and 0.1484–0.2032, respectively. The genetic distance between populations F and Y was the largest (0.331), while it was the smallest between populations T and S (0.217). UPGMA dendrogram analysis showed that populations S, T and Y clustered onto one branch, and population F formed another branch. Except for four individuals, the other samples from population F clustered onto one branch, and most samples of populations S, T and Y clustered with their respective populations, while a small number of them were mixed together. AMOVA analysis showed that 35.92% of the variation was among populations and 64.08% variation was within populations. Fst (0.3592) among populations indicated large genetic differentiation. The germ styles of populations S, T and Y were similar, but they were different from that of population F. The results of this study accumulated information on the genetic background ofthat will be useful in genetics and breeding and can provide basic information for further development of specific molecular markers in different populations.

; genetic diversity; AFLP; geographical populations

Mar. 14, 2016

[China Agriculture Research System, No.CARS-47; Guangdong Marine Fishery Science & Technology and Industry Development Special Key Project, No. A201501A06; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No.2013B020201001; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No. 2014B020202003]

S917

A

1000-3096(2017)03-0041-07

10.11759//hykx20160314001

2016-03-14;

2016-10-08

现代农业产业技术体系(CARS47); 广东省海洋渔业科技与产业发展专项重点项目(A201501A06); 广东省科技计划项目(2013B020201001); 广东省科技计划项目(2014B020202003)

孙苗苗(1983-), 男, 江苏徐州人, 博士, 主要从事水产动物遗传育种与增养殖学研究, E-mail: miaosun2007@163.com; 周发林, 通信作者, E-mail: zhoufalin@aliyun.com